Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I | Protocol (Translated to French)\nÀ l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I\nComme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.\nAneuploïdie embryonnaire est la principale cause génétique de la stérilité chez l’homme. La plupart de ces événements sont créés au cours de la méiose femelle, et quoique corrélés avec l’âge maternel, âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Donc, les variantes génétiques pourraient expliquer pour la ségrégation des chromosomes incorrect au cours de l’ovogenèse. Étant donné que l’accès à des ovocytes humains est limitée à des fins de recherche, une série de tests ont été développés pour étudier la fonction du gène humain au cours de la méiose I à l’aide des ovocytes de souris. Tout d’abord, l’ARN messager (ARNm) du gène et variant du gène d’intérêt sont microinjected dans des ovocytes de souris que j’ai arrêté la prophase. Après avoir laissé le temps à l’expression, ovocytes sortent de façon synchrone en maturation méiotique pour compléter la méiose I. Par le marquage de l’ARNm avec une séquence d’un reporter fluorescent, tels que de la protéine fluorescente verte (Gfp), la localisation de la protéine humaine peut être évaluée en plus les altérations phénotypiques. Par exemple, gain ou perte de fonction peut être étudiée par l’établissement de conditions expérimentales qui remettent en question le produit du gène pour corriger les erreurs méiotiques. Bien que ce système est avantageux dans les enquêtes sur la fonction de protéine humaine durant l’ovogenèse, l’interprétation adéquate des résultats devrait être entreprise, étant donné que l’expression de la protéine n’est pas aux niveaux endogènes et, à moins que contrôlé (c'est-à-dire frappé out ou vers le bas), murins homologues sont également présents dans le système.\nL’infertilité est une maladie qui touche 10 à 15 % de la population humaine d’âge procréateur 1, d'où presque moitié cherche un traitement médical 2. Bien que l’étiologie de l’infertilité est diversifiée et une anomalie génétique la plus courante chez l’homme est souvent multifactorielle, aneuploïdie embryonnaire 3. Aneuploïdie est définie comme l’écart (gain ou perte) du bon nombre de chromosomes dans une cellule. Le phénomène de l’aneuploïdie sur les embryons humains est fréquent et augmente avec l’âge maternel avancé 4,5. Quatre essais comparatifs randomisés ont mis en évidence l’avantage de la sélection des embryons (euploïdes) seulement chromosomique normales pour le transfert de l’utérus parce que cette stratégie a donné lieu à des taux accrus d’implantation, taux d’avortement spontané et un temps plus court pour atteindre la grossesse 6,7,8,9. Par conséquent, comprendre l’étiologie de l’aneuploïdie humaine peut avoir des implications importantes en procréation assistée.\nBien que le dépistage génétique pré-implantatoire pour aneuploïdies est bénéfique dans les traitements contre l’infertilité, une compréhension approfondie de la façon dont sont originaires les aneuploïdies fait encore défaut. Il est largement admis qu’il existe une corrélation positive des aneuploïdies méiotiques (son originaires au cours de la production des gamètes) et âge de la mère, cependant, certains taux d’aneuploïdie embryonnaires présents des femmes qui s’écartent de la moyenne pour leur âge donné 4. Ces cas donnent à penser que l’âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Autres facteurs peuvent jouer un rôle dans l’augmentation du risque d’aneuploïdie embryonnaire, comme les variantes génétiques.\nUn aspect clé de l’enquête sur la contribution potentielle d’un variant du gène de l’aneuploïdie au cours de la méiose de l’ovocyte est de concevoir un système pour évaluer rapidement la fonction du gène méiotique. En raison des contraintes éthiques et un accès limité, il est impossible de réaliser ces expériences à l’aide d’ovules humains. Ces problèmes peuvent être contournés en utilisant des ovocytes de souris, et ici une série de tests pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I sont décrites. Par microinjecting l’ARN messager (ARNm) codant pour la variante du gène d’intérêt, la localisation de la protéine humaine dans le œuf de souris peut être visualisée et utilisée pour déterminer si l’expression ectopique de la protéine humaine sauvage et mutante dans un altérations phénotypiques qui pourraient conduire à une aneuploïdie. Ces phénotypes comprennent une augmentation dans les microtubules qui s’attachent à la mauvaise sœur kinétochore et l’incapacité de soutenir l’alignement des chromosomes en métaphase de la méiose I. ce qui est important, ce protocole peut être utilisé pour étudier le gain et perte de fonction variants génétiques en établissant des conditions expérimentales spécifiques à contester les événements clés de la méiose de l’ovocyte tels que broche d’alignement bâtiment et le chromosome 10.\n1. molecular Cloning\nObtenir le DVD complet séquence codante du gène d’intérêt et le plasmide dans vitro transcription (pIVT) vecteur11.\nNOTE : Clones d’ADNc pleine longueur sont disponibles dans le commerce de différents fournisseurs ou peuvent être générés via la chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR). Le Centre National de ressources en ligne Biotechnology Information (NCBI) fournit des séquences de la transcription des gènes de nucléotide et exprimés séquence étiqueté les bases de données (EST). Pour la facilité de la protéine, visualisation et l’analyse des niveaux d’expression, fusion de la protéine fluorescente verte (Gfp) ou une autre balise fluorescente appropriée peuvent être souhaitable dans la stratégie de clonage.\nEn utilisant une stratégie de clonage validée, insérez la séquence codante du gène d’intérêt dans la région de clonage multiples de pIVT. Une description détaillée du clonage moléculaire et les étapes nécessaires ont été précédemment décrits 12.\nRemarque : Si un produit de gène-fusion doit être générée, veillez à ce que le clonage est dans le cadre de lecture adéquat.\nSéquence de la construction à l’aide des amorces de globine afin d’assurer l’insertion du gène correcte, bonne fusion dans le cadre, et qu’aucune mutation induite par la polymérase de point ont été créées.\nRemarque : Si l’équipement de séquençage de l’ADN Sanger n’est pas disponible, beaucoup de compagnies offre faible coûts options de séquençage de l’ADN.\nMutagenize ADN si génère des polymorphismes de nucléotides simples (SNP) ou insertions/délétions (INDELS). Mutagénèse d’ADN est décrite dans les étapes 1,5 à 1,7 ci-dessous. Pour des constructions de type sauvage, passez à l’étape de linéarisation 1.7.\nConcevoir des amorces de mutagenèse et compléter la réaction de PCR de mutagenèse pour générer la construction mutante selon le protocole du fabricant. PCR-mediated de mutagénèse dirigée a été décrit précédemment 13. En outre, beaucoup de compagnies offre des kits de mutagenèse incluent les protocoles.\nTransformer mutagénisé ADN hôte bactérien. Isoler et purifier les plasmides.\nRemarque : Beaucoup d’entreprises font des kits qui peuvent être utilisés pour isoler et purifier l’ADN plasmidique facilement. Suivre le protocole de fabricants en conséquence. Si vous utilisez une souche bactérienne Gram-négative telles que Escherichia coli, il est recommandé d’utiliser un kit qui supprime des endotoxines.\nSéquencer l’ADN isolé des transformants bactériennes à l’aide de standard séquençage Sanger pour confirmer l’introduction du SNP ou INDEL désirée.\nLinéariser des produits finaux à l’aide de la même enzyme de restriction digestion de l’ADN purifié.\nRemarque : Le vecteur pIVT contient plusieurs single-enzyme coupe sites inscrits sur la carte plasmidique sur Addgene 14.\nS’assurer que le produit est linéaire par électrophorèse sur gel d’agarose. La méthode d’électrophorèse sur gel d’agarose a été précédemment défini 14.\nRemarque : Pour toutes les étapes restantes, utilisez embouts barrière (filtre) et des matériaux sans RNase pour assurer une production stable et de haute qualité RNA.\nPurifier le produit digéré à l’aide d’un protocole de nettoyage ADN ou kit validé et éluer dans de l’eau exempte de RNase/DNase 30 µL.\nNOTE : Spin de silice-matrice colonne à base de produits sont recommandés pour la qualité, purifié l’ADN. Suivre le protocole de fabricants en conséquence.\nIn vitro transcrire ADN polymérase T7 suivant le protocole du fabricant à l’aide.\nPurifier et éluer l’ARN dans 30 µL d’eau libre de RNase ni DNase utilisant un kit de purification de basée sur les colonnes des acides nucléiques spin de silice-matrice suivant le protocole du fabricant.\nEffectuer la dénaturation électrophorèse sur gel d’agarose à l’aide de formaldéhyde pour confirmer la taille finale du produit RNA. Reportez-vous aux étapes 1.13-1,22 au-dessous de 14. (Figure 1).\nPréparer le gel en chauffant 1 g d’agarose dans 72 mL eau jusqu'à dissolution, puis laisser refroidir à 60 ° C.\nPréparer 10 X vadrouilles tampon en cours d’exécution en ajoutant des vadrouilles 0,4 M (pH 7,0), acétate de sodium 0,1 M et EDTA 0,01 M.\nAjouter 10 mL de 10 X vadrouilles exécutant tampon et 18 mL de 37 % de formaldéhyde (12,3 M) à la solution d’agarose refroidi.\nCaste le gel en versant la solution d’agarose dans un conteneur de formation de gel. Utilisez un peigne assez grand pour accueillir 10 µL. Après que gel a sélectionné et est ferme au toucher, retirez délicatement le peigne.\nAssembler le gel dans la cuve d’électrophorèse et ajouter assez 1 X vadrouilles tampon, assurant que le gel soit complètement recouvert.\nPréparation échantillons RNA en ajoutant 1 µg d’ARN à 0,5 volumes X de colorant de chargement contenant du formaldéhyde.\nAjouter le bromure d’éthidium à RNA solution à une concentration de 10 µg/mL.\nDénaturer la solution échantillon RNA à 70 ° C pendant 5 min.\nÀ l’aide de stérile, 10 µL pointes à filtre, charger 5 µL de marqueur de poids moléculaire et 5 µL d’ARN échantillons dans les puits séparés du gel et electrophorese à 5 V/cm jusqu'à ce que la teinture a migré au moins deux-tiers de la longueur du gel.\nVisualiser l’ARN dans le gel sur un illuminateur de trans UV. S’assurer que l’ARN est la bonne taille en comparant le marqueur de poids moléculaire.\nPour mesurer la concentration et la pureté de l’ARN, transférer 1,2 µL d’ARN purifié à l’aide de filtre stérile de µL 10 conseils sur un spectrophotomètre UV.\nNotez que RNA haute qualité devrait avoir rapports absorbance A260/280 (1,8 à 2,2) et 260/230 (> 1,7) respectivement.\nEn utilisant 10 µL bouts filtrants, aliquotes le restant de l’ARN purifié dans 0,5 µL centrifugation des tubes stériles (3-5 µL/tube). Stocker les tubes à-80 ° C jusqu’au moment de microinjection.\nRemarque : Une concentration de la dernière injection de 500 ng/µL est un point de départ optimal. Il est recommandé de diluer RNA 1:2 en RNase libre H20 avant microinjection pour réduire la viscosité de l’ARN dans la pipette de micro-injection.\n2. kinétochore-Microtubule attachement Assay\nDiviser les ovocytes en groupes égaux de microinjection.\nNOTE : Collecte des ovocytes, transfert, microinjection et maturation méiotique a été décrite en détail dans JoVE précédemment 15.\nMicroinject un groupe avec l’ARNm expérimentale et les autres groupes au contrôle WT ou Gfp et PBS ARNm.\nNOTE : 500 ng/µL est la concentration d’injection recommandé de commencer par 10. Un picoinjector peut être utilisé pour contrôler la quantité d’injection. Un volume d’injection de 5-10 pL est recommandé 15.\nÀ l’aide d’une main ou la bouche des appareils pipetage à jeton où le verre pipette ouverture est légèrement plus grand que le diamètre d’un ovocyte (100-150 µm), transfert des ovocytes dans une goutte de 100 µL de milieu de culture sans milrinone dans une boîte de Pétri couverts en huile minérale de qualité embryonnaire et incuber pendant 7 h à 37 ° C en 5 % C02 pour permettre la maturation suffisante jusqu'à la métaphase de la méiose, les ovocytes j’ai (j’ai rencontré) 15.\nAprès incubation, utilisant le même appareillage de pipette comme ci-dessus, transfert des ovocytes dans une boîte de Petri orgue Centre-puits contenant 700 µL de milieu collection préalablement réfrigérées média essentiel minimum (MEM) dans le centre bien et 500 µL H20 dans l’anneau extérieur et Placer le plat sur la glace pendant 7 min.\nRemarque : Il est recommandé de refroidir des médias MEM et de centrer bien Pétri orgue à-20 ° C pendant au moins 20 min avant le traitement des ovocytes.\nDifficulté les ovocytes en transférant à l’aide de l’appareil de la pipette dans un puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL de paraformaldéhyde à 2 % en 1 X PBS pendant 20 min à température ambiante.\nUtilisant la même pipette appareil, transférez les ovocytes dans un autre puits sur une plaque spot contenant 400 µL de solution de blocage (0,3 % de BSA + 0,01 % Tween-20 + 0,02 % NaN3, PBS) et magasin à 4 ° C jusqu’au moment de traiter pour immunostaining.\nRemarque : pour le stockage des ovocytes à 4 ° C, plaque spot lamelle couvre-objet avec parafilm pour éviter l’évaporation.\nUtilisant le même appareillage de pipette, ovocytes transfert à un nouveau puits sur un terrain plat contenant 400 µL de solution de perméabilisation (PBS BSA de 0,3 % + 0,1 % TritonX-100 + 0,02 % NaN3) et incuber à température ambiante pendant 20 min. ovocytes transfert rapidement par le biais de trois gouttes de 400 µL bloquant la solution pour supprimer n’importe quel détergent résiduel.\nRemarque : Une plaque de verre clair 9 puits spot fonctionne bien pour aller de groupes par le biais de traitements multiples en un seul plat (étapes 2,4-2,5).\nEffectuer les reste des procédures immunocytochimie dans une chambre humidifiée, abri de la lumière à température ambiante. Utiliser un récipient en plastique de taille moyenne doublé avec un essuie-tout humide et couvrir avec du papier aluminium.\nEn utilisant l’appareil de la pipette, transférez les ovocytes dans 30 µL bloquant la solution sur le couvercle d’une plaque à 96 puits et les place dans la chambre humidifiée pendant 10 min.\nNOTE : Les gouttes sont placés dans les renfoncements circulaires sur la plaque.\nPour étiqueter des centromères et la tige, à l’aide de l’appareil de la pipette, transférez les ovocytes à 30 µL bloquant la solution contenant l’antigène anti-centromérique (ACA, Crest) (01:30) et anti-acétylé tubuline (1 : 1000) et incuber pendant au moins 1 heure.\nRincez les ovocytes en transférant par gouttes trois 30 µL de bloquant la solution pendant 10 min chaque.\nÀ l’aide de l’appareil de la pipette, transfert des ovocytes à un 30 µL goutte de solution de saturation contenant des anticorps secondaires gratuits aux anticorps utilisés ci-dessus (anti-humain IgG 1 : 200, 1 : 200 de anti-souris IgG) et incuber pendant 1 heure.\nRépétez les étapes de rinçage de 10 min 3, dans 30 µL solution de blocage comme indiqué au point 2.11.\nTransférez les ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans 3-5 µL montage moyen contenant DAPI (5,9 µg/µL) sur une lame de microscope.\nPlacer 4 petites gouttes (taille d’une tête d’épingle) de gelée de pétrole sur les coins de la lamelle couvre-objet pour empêcher l’écrasement des ovocytes.\nDéposer délicatement la côté de vaseline de lamelle couvre-objet sur le toboggan.\nSceller la lamelle bords avec clairement vernis à ongles et laisser pour sécher pendant 5 min.\nStocker les lames à 4 ° C, abri de la lumière, jusqu’au traitement par microscopie confocale.\nRemarque : Assurez-vous que l’indice de réfraction du milieu de montage et lamelle, matches les objectifs de microscope utilisés. Montage recommandées matériaux ont été précédemment décrit 15.\nImage des ovocytes en utilisant un objectif de 40-63 x sur un microscope confocal, capturant les petits pas (≤ 1 µm) dans le plan z, optimisé pour le travail objectif et l’image de l’ensemble de la région de la broche de la métaphase.\nRemarque : Assurez-vous d’image toutes les 3 canaux fonction spécifiques Anticorps secondaires utilisés à l’étape 2.11. Image en moyenne ≥ 4 et un zoom de 3 est idéal pour une résolution suffisante. Une taille de palier 1 µm fournit une visualisation claire des microtubules kinétochores dans des ovocytes de souris. La procédure de capture d’image variera d’un microscope à un microscope. Veuillez consulter le guide de l’utilisateur confocal de fabricants pour des mesures précises sur la façon de configurer les paramètres du microscope.\nDéterminer l’état de fixation kinétochore-microtubule en utilisant des logiciels d’imagerie suivant étapes 2.21-2.23 ci-dessous.\nRemarque : Les étapes suivantes décrivent cette procédure à l’aide d’un logiciel téléchargeable gratuit Image J (NIH), cependant, l’autre logiciel d’imagerie peut être utilisé. Pièce jointe types ont été précédemment défini 16 .\nOuvrez l’image en faisant glisser le fichier dans la barre d’outils Image J.\nDans la série-z ouverte, faire tous les canaux visibles (ADN, kinétochore et broche) en cliquant sur «canaux de fusion», disponible dans le menu déroulant «Image», sous le sous-onglet «couleur».\nÀ l’aide de la bascule au bas de l’image, passer chaque tranche z et déterminer l’attachement des microtubules kinétochores. Fixation détaillée descriptions ont été précédemment décrit 16\n3. essai de défi alignement du chromosome\nEn utilisant l’appareil de pipette comme indiqué au point 2.3, transfert des ovocytes dans une goutte de 100 µL de milieu de culture sans milrinone sous huile et incuber pendant 7 h afin de permettre une maturation suffisante jusqu'à la métaphase de la méiose, les ovocytes j’ai (j’ai rencontré) comme décrit dans l’étape 2.3 17 .\nRemarque : Les procédures de collecte, microinjection et la maturation ovocytaire ont été décrits précédemment 15. Consulter le protocole d’essai de pièce jointe à l’étape 2.1-2.2 pour les contrôles et pour les concentrations de microinjection de RNA.\nUtilisant le même appareillage de pipette, ovocytes transfert à une culture d’organes puits Centre plat contenant 700 µL milieu de culture contenant monastrol [100µm] dans le centre bien et 400 µL H20 dans l’anneau entourant et incuber à 37 ° C pendant 2 h.\nRincez le monastrol par le transfert des ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette comme ci-dessus, par le biais de trois gouttes de 100 µL CZB milieu de culture et puis transférez les ovocytes à un nouveau centre-puits orgue boîte de Petri contenant 700 µL de milieu culture + MG132 [5 µM] pendant 3 h dans le centre bague. Ajouter 400 µL H20 de l’anneau extérieur.\nDifficulté les ovocytes de transférer, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans un puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL 2 de paraformaldéhyde % dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.\nAprès fixation, transférez les ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans un nouveau puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL solution de saturation et de conserver à 4 ° C jusqu’au traitement d’immunomarquage.\nPermeabilize et l’étiquette des ovocytes par immunocytochimie comme décrit aux points 2.6-2.16.\nOvocytes en utilisant un objectif de 40-63 x sur un microscope confocal, capture d’image < 1 µm pas dans le plan z en veillant à l’image de l’ensemble de la région de la broche de la métaphase.\nPour définir l’alignement du chromosome statut ouvrir des fichiers image à l’aide de logiciels d’imagerie.\nRemarque : Les étapes suivantes décrivent cette procédure à l’aide d’un logiciel téléchargeable gratuit Image J (NIH), cependant, l’autre logiciel d’imagerie peut être utilisé.\nFaites glisser image dans Panneau de configuration image J.\nDans la série-z ouverte, utilisez l’outil de point (accessible en cliquant sur l’icône dans la barre de contrôle Image J point) pour marquer des points à la fin de chaque pôle du fuseau dans leur respectif z-tranche en plaçant l’outil au-dessus du pôle du fuseau dans l’image en cliquant sur l’image. Ajouter ces points dans la région de gestionnaire d’intérêt (ROI) en appuyant sur commande + t sur le clavier.\nDéterminer les coordonnées spécifiques pour chacun des emplois définis à l’étape 3.10 en sélectionnant le point spécifique dans le gestionnaire de ROI, puis en cliquant sur le bouton de mesure. Cela fournira un résultats contenant de table coordonnées x et y pour chaque point. Ce seront les points X1, Y1 et X1, Y2, respectivement.\nEnsuite, déterminez la coordonnée Z de true. Cela se fait en multipliant le nombre de tranche de la z-tranche spécifique dans la pile de z dans lequel figurait le pôle du fuseau (c.-à-d. tranche #2 de 6) c'est-à-dire par chaque point individuel dans l’épaisseur de la pile (c'est-à-dire 1 µm) (exemple : couper 2 x 1 µm = 2). Ceux-ci seront respectivement les points Z1 et Z2.\nDéterminer la longueur d’axe à l’aide de l’équation du théorème de Pythagore (a2 + b2 = c2) en utilisant le défini précédemment x, y et z coordonnées des étapes 3.11-3.13. Pour chaque axe la longueur finale est égale à :\nDéterminer le milieu de l’axe. Cela correspond à la moitié de la longueur de la broche. À l’aide de l’outil en ligne dans l’Image J, en cliquant sur l’icône de la ligne dans la barre d’outils Image J, tracez une ligne qui est d’un pôle du fuseau pour le milieu de l’axe. La longueur s’affichera dans la barre d’outils Image J.\nDéterminer statut d’alignement du chromosome en évaluant la distance de chromosome de la milieu de la broche à l’aide de l’outil de mesure de ligne. À l’aide de l’outil en ligne disponible en cliquant sur l’icône de la ligne dans la barre d’outils Image J, tracer une ligne depuis le milieu de l’axe au chromosome. La longueur s’affichera dans la barre d’outils Image J. Supérieur à 4 µm de la milieu de l’axe des chromosomes sont considérés comme non aligné 18.\nAprès in vitro transcription haute qualité RNA aura un ratio A260/A280 (1,8 à 2,2) et un ≥1.7 de ratio A260/A230 lorsqu’elle est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. L’image dans la Figure 1 montre la migration de in vitro-produit RNA sur un gel d’agarose dénaturation après électrophorèse. Un groupe qui est étalé dans le modèle ou un échantillon qui a plusieurs bandes de tailles peut indiquer la contamination ou la dégradation de l’échantillon. Alternativement, les bandes multiples peuvent indiquer que l’ARNm n’est pas complètement dénaturé ou le plasmide de départ n’était pas complètement linéarisé. L’ARNm s’exécutera plus grande que prévu à cause de la queue poly-adenylated intégrée dans pIVT, qui permet l’expression stable de mRNA in vitro. Après microinjection, il est recommandé de s’assurer que les volumes d’injection uniforme et les niveaux d’expression par microscopie de fluorescence. L’image dans la Figure 2 montre la prophase ovocytes j’ai arrêté uniformément injectés avec Gfp. Technique de microinjection cohérente est essentielle pour ce protocole. Logiciel d’analyse image, comme Image J, peut servir à valider les niveaux d’expression afin d’assurer l’uniformité et la maîtrise de la technique. Notez que la localisation sous-cellulaire informations peuvent être obtenues en faisant de l’imagerie pour les deux tests. Pour toutes les expériences de microinjection évaluer les effets d’un variant du gène, le gène sauvage doit être injecté dans un sous-ensemble d’ovocytes pour servir un contrôle. Cela permet au contrôle pour des phénotypes potentiels de la surexpression du gène humain dans un ovocyte de souris. PBS, ou Gfp pour constructions marqués au fluorophore, devrait être également être injecté dans un sous-groupe d’ovocytes au contrôle pour les phénotypes induite par microinjection. Pour des constructions sans étiquette fluorescente, Gfp ARNm peut être injecté conjointement pour assurer suffisamment microinjection. Si co de s’injecter simultanément deux ou plusieurs constructions n’oubliez pas d’augmenter la concentration de l’ARNm, telle que la solution finale contient 500 ng/µL de chaque ARNm.\nLe dosage de microtubules stables froid fournit un outil précieux pour évaluer l’état de l’attachement des kinétochores aux microtubules. La figure 3 est une z-projection d’une image de microscope confocal une métaphase I ovocyte. Cet ovocyte a été soumis à traitement de médias froids pour dépolymériser tous les microtubules qui n’avaient pas joint aux kinétochores. Les ovocytes qui ont été traités pour un temps insuffisant contiendra des fibres de microtubules ne pas attachés aux chromosomes (trop court entraîne trop de fibres) ou manque de fibres tous ensemble (les résultats trop longs dans aucune structure de broche) et il est recommandé que ces ovocytes ne pas être utilisées dans l’analyse. En métaphase de la méiose j’ai il est courant pour les ovocytes contenir les kinétochores seules ou attachés latéralement, c’est pourquoi il est recommandé qu’un groupe témoin servir dans toute étude de pièce jointe. En moyenne, ovocytes sauvage contient 5 à 10 % des kinétochores à volonté MI pas encore être solidement attaché 19. Il est essentiel que tous les ovocytes soient au même stade pour l’analyse du statut de pièce jointe kinétochore-microtubule. Pour veiller à ce qu’expérimental et le groupe témoin mature avec des échelles de temps semblables il est recommandé d’évaluer la cinétique du cycle cellulaire. Pour effectuer ce test, un sous-ensemble des ovocytes expérimentales et de contrôle doit être mûri et visible direct sous les microcopy Time-lapse. L’utilisation de milrinone permet ovocytes à synchroniser en prophase de la méiose I, tel que communiqué dans des milieux dépourvus de milrinone avec permettent de reprise de la méiose à la même heure 20. Ovocytes de contrôle et de groupes expérimentaux doivent s’écouler un globule polaire, indicatif d’atteindre la métaphase de la méiose II (II a rencontré), à des points similaires. Si microscopie des cellules vivantes n’est pas disponible, les ovocytes peuvent être mûri à Met je (7 h) et à rencontré II (16 h), fixées et colorées pour détecter l’ADN et les microtubules comme décrit précédemment. Au Met I et II a rencontré une broche en forme de tonneau, bipolaire doit être visible. Dans les ovocytes de contrôle, les chromosomes sont alignés à la plaque métaphasique. L’alignement des chromosomes sera différente dans les groupes expérimentaux selon variante affecte, cependant, les chromosomes devraient être condensés et attachés aux microtubules avec la majorité des chromosomes situé sur l’axe. Un nombre similaire d’ovocytes doit avoir atteint la méiose II en contrôle et groupes expérimentaux. Afin de réduire les difficultés dans la détermination de fixation statut qu'il est recommandé d’imagerie ovocytes à l’aide de petits pas dans le plan z, optimisé pour l’objectif spécifique de travail. Analyse concernera Regarde un z-tranches individuellement et en fusion des paramètres pour déterminer quel pôle attachés aux microtubules émanent. Figure 3 b illustre des exemples de pièces jointes anormale kinétochore-microtubule. Montré est un bivalent dans laquelle seule sœur paire kinétochore est attachée à un microtubule broche, défini comme un aucun attachement. Ensuite, un attachement de syntélique s’affiche dans lequel les deux soeur paires kinétochore sont attachés au même pôle du fuseau. Enfin, un attachement de Kinetochores s’affiche dans laquelle une sœur kinétochore est attaché aux deux pôles du fuseau tandis que l’autre sœur kinétochore de la paire est attaché à un poteau de broche unique.\nLes images dans la Figure 4 illustrent les ADN attendu progressive et les configurations de broche comme on passe à travers les étapes de l’analyse de défi de l’alignement des chromosomes. Dans cet essai, il est essentiel que les différents groupes expérimentaux progressent grâce à la méiose et la cinétique similaire. Comme décrit précédemment, il est recommandé de compléter les analyses de cinétique du cycle cellulaire avant d’effectuer l’essai de défi. Dans cet essai, la capacité pour les ovocytes de corriger avec succès attachements anormaux kinétochore-microtubule est évaluée. Pour tester ceci, les ovocytes sont affinés tout d’abord à Met j’à autoriser les pièces jointes kinétochore-microtubules à établir. Ensuite, les ovocytes sont incubés dans monastrol et inhibiteur de la kinésine 5 (EG5), qui s’effondre l’axe bipolaire dans une broche monopolaire 21. La génération de la quenouille monopolaire induit 100 % accessoires de microtubule-kinétochore incorrect. L’inhibiteur de la monastrol est alors délavé pour permettre le recouvrement. Au cours de la période de récupération, les ovocytes régénèrent un axe bipolaire et tentent de corriger les pièces jointes de microtubules. Ajout de l’inhibiteur du protéasome MG132 empêche l’apparition de l’anaphase. Comme un contrôle, un petit sous-ensemble des ovocytes de chaque groupe expérimental peut être fixé à chaque étape du protocole (rencontra I, monastrol traité, poster de récupération) pour s’assurer que tous les groupes répondent aux traitements et dans la même mesure. Métaphase I ovocytes doivent contenir un axe bipolaire en forme de tonneau avec chromosomes alignés dans la plaque métaphasique. Ovocytes traités avec monastrol devraient contenir une broche monopolaire avec chromosomes orientés autour du pôle unique. Ovocytes récupérés doivent contenir une fois de plus un axe bipolaire en forme de tonneau. Alignement de chromosome est défini comme toute chromosomes plus de 4 μM de la topographie de broche 22. Il est utile colorer les ovocytes pour détecter l’ADN et kinétochores pour établir si les deux kinétochores sont en dehors de cette zone centrale comme cela peut être difficile de déterminer à l’aide de la détection de l’ADN seulement.\nFigure 1. Électrophorèse en gel d’ARN Denaturingagarose. Taille et qualité de RNA peuvent être évaluées par l’électrophorèse sur un gel d’agarose dénaturation. Un gel dénaturant est recommandé pour prévenir la formation de la structure secondaire. Lane 1 contient un marqueur de poids moléculaire de RNA. 2 Lane est un échantillon de RNA. Notez que l’ARN s’exécutera plu calculées à cause de la queue polyA intégré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 2. Validation de microinjection ovocytaire. Microscopie fluorescente peut être utilisée pour valider l’expression et la microinjection ovocytaire réussie. Des ovocytes j’ai arrêté de la prophase micro avec Gfp figurent après expression durant la nuit de la construction. Cette image a été obtenue à l’aide de la Invitrogen EVOS FL Auto système équipé de lumière cube GFP d’imagerie. Barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 3. Évaluation des pièces jointes kinétochore-microtubule. (A) A représentant z-projection d’un froid imprégnées j’ai rencontré ovocyte. Broche (vert), kinétochores (rouges) et l’ADN (bleu) sont indiquées. La boîte indique la région du zoom optique. Pointes de flèches indiquent les bout fixations des kinétochores aux microtubules d’un seul bivalent. Barre d’échelle est 10 µm pour broche, kinétochore, ADN et canaux de fusion. Echelle de zoom optique est de 5 µm. (B) exemples de types de pièces jointes anormale kinétochore-microtubules dans les ovocytes de souris. Les flèches indiquent les sites d’attachement kinétochore-microtubule. Barre d’échelle est 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 4. Analyse de défi de l’alignement des chromosomes. Organigramme de la procédure avec z-projections représentant des ovocytes à chaque étape. Les ovocytes sont affinés tout d’abord à la métaphase de la méiose j’ai (j’ai rencontré), puis transféré à une autre boite contenant monastrol pendant 2 h à induire la formation de broche monopolaire. Prochaines ovocytes sont autorisés à récupérer dans le milieu de maturation additionné d’un inhibiteur du protéasome (MG132) pour prévenir l’apparition de l’anaphase pendant 3 h. Une fois récupérées les ovocytes sont fixe, étiquetés pour broche (vert), kinétochores (rouges) et l’ADN (bleu) et imagés par l’intermédiaire de la microscopie confocale à déterminer le statut de l’alignement. Les lignes indiquent la longueur de la broche (40 µm) et milieu (20 µm), déterminée à l’aide du théorème de Pythagore équation de broche. Les flèches indiquent les positions outil point à chaque pôle. Les kinétochores > 4 µm depuis le milieu de l’axe sont considérés comme des non alignés. Astérisque indique chromosome non aligné (5,6 µm de milieu). Barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nEn raison de l’identification rapide et croissante des humains variantes génétiques associées à la maladie, il est essentiel que les systèmes sont établies afin d’évaluer leur importance biologique. Comprendre la fonction des protéines dans la méiose humain pose des défis particuliers car les ovocytes humains sont précieux et sperme rare et humaine ne se prêtent pas aux manipulations génétiques. Les ovocytes de souris sont un système modèle mammifère précieux pour l’évaluation humaine gène méiotique fonction 10,23. Ce modèle permet de contourner l’impossibilité d’utiliser les ovules humains tout en fournissant une source facilement accessible d’ovocytes à faible coût, manipulables qui subissent la méiose semblable aux cellules germinales humaines tout en étant utiles à la compréhension des variants génétiques comment peut-être avoir une incidence femelle fertilité.\nParce que ces méthodes utilisent l’expression ectopique de la protéine humaine dans des ovocytes de souris par microinjection, il est essentiel d’établir tout d’abord une concentration du contrôle, les ARN sauvage qui n’altère pas la maturation méiotique. Il est recommandé que la maturation méiotique cinétiques sont surveillés (ventilation de l’enveloppe nucléaire, extrusion de globule polaire) dans des ovocytes de contrôle pour définir des paramètres de ligne de base et évaluer la morphologie broche et chromosome. En outre, assurant des volumes de microinjection uniforme est essentiel pour comparer les groupes. Incluant une balise fluorescente sur le gène d’intérêt peut simplifier ce défi technique. Techniques pour maîtriser la microinjection ovocytaire ont été précédemment démontré 15. Visualisation des ovocytes injectés sous un microscope à fluorescence ou de mesurer l’expression de la protéine par l’intermédiaire de la tache occidentale sont également des outils précieux pour confirmer des concentrations compatibles injection.\nParce que les erreurs dans la ségrégation des chromosomes dans des ovocytes de mammifères sont une cause importante d’aneuploïdie embryonnaire et grossesse perte5, analyse des pièces jointes kinétochore-microtubule offre un outil précieux pour évaluer si un gène d’intérêt affecte ségrégation des chromosomes (c.-à-d. une mauvaise pièce détachée cause mauvaise ségrégation). Une exposition de 10 min aux médias réfrigéré est suffisante pour dépolymériser microtubules qui ne font pas un attachement kinétochore-microtubule, permettant la visualisation des attachements stables par microscopie confocale 24. Pour ce test, il est important de ne pas trop refroidir les ovocytes que cela conduira à la dépolymérisation des microtubules stables. En outre, optimisation des procédures de coloration est la clé pour la visualisation des structures kinétochore et les microtubules. Pour assurer la résolution de l’image adéquat pour l’analyse, de petites étapes (≤ 1 μm) dans le plan z à l’aide d’un x-63 40 x objectif devrait être capturé, et obtention d’images à travers la structure de broche ensemble pour s’assurer que toutes les pièces jointes sont visibles. Notez qu’il est fréquent d’avoir des kinétochores seules pendant prométaphase de la méiose j’ai 25.\nLe test de défi d’alignement chromosomique est utile pour l’évaluation des variantes de gain ou perte de fonction. Variantes de gain de fonction peuvent être difficiles à évaluer car les ovocytes de souris de jeunes femelles présentent de faibles taux d’aneuploïdie. Ce test permet de surmonter cet obstacle en générant une situation dans laquelle l’ovocyte doit corriger pièces jointes expérimentalement induite kinétochore-microtubule incorrect. Création d’un point de temps dans lequel contrôle ovocytes contiennent 1-2 chromosomes mal alignées après que récupération fournit un scénario quantifiable permettant de déterminer si un mutant offre une efficacité accrue de l’alignement (c'est-à-dire meilleur alignement capacités seront protéger les euploïdie). Pour la quantification du désalignement du chromosome, un protocole établi précédemment dans quels chromosomes supérieures à 4 μm de l’axe du milieu sont caractérisées comme non aligné peut être utilisé 18.\nAfin d’étudier les variantes de la perte de fonction, les conditions expérimentales supplémentaires sont nécessaires en raison de l’endogène homologue au sein du système d’étude. Une façon d’atténuer ce problème est d’utiliser ou de générer un modèle de souris knockout de la variante d’intérêt. L’avènement du système de bac à légumes/Cas9 pourrait fournir un moyen rapide pour générer ces masquages 26. Par ailleurs, si un modèle de coup de grâce n’est pas une option, techniques knockdown classiques tels que co injection d’oligonucléotides antisens morpholino ou petits ARN interférants pourraient être employés. Cependant, attention à la conception de la séquence est nécessaire afin d’éviter toute interférence avec la variante micro-injection sous étude. Par exemple, l’oligonucléotide morpholino pourrait être conçu pour lier à la région 5' non traduite (5' UTR) du gène souris qui ne figure pas dans la variante humaine de mRNA introduite par microinjection. Si vous utilisez interférant petit RNAs celui pourraient cibler une région de séquence non homologue ou d’introduire des silencieux des mutations ponctuelles du gène humain qui auraient échapper ciblant. Cependant, avoir la copie de protéine endogène encore présente sur l’expression de la variante peut être instructive puisque de nombreuses variantes sont présents à l’état hétérozygote dans le génome humain.\nEnfin, bien que ne pas décrits dans le présent protocole, évaluation d’aneuploïdie chromosomique peut facilement évaluée d’oeufs II a rencontré que le test final en préparation pour l’analyse de variante humaine. Une description détaillée de cette in situ du chromosome répartis protocole a décrit précédemment de 15. En bref, micro-injection ovocytes sont ayant subi une maturation in vitro jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade II a rencontré, après un traitement avec un agent de dépolymérisation de fuseau méiotique avant fixation. Kinétochore et chromosome coloration comme décrit ici permettent pour l’évaluation du contenu chromosomique.\nAlors que les ovocytes de souris offrent un outil précieux pour l’étude des protéines essentielles à la méiose femelle quelques limitations à l’exister de modèle. Surexpression de protéines peut perturber la maturation méiotique et donc une concentration d’ARN peut ne pas exister qui n’induit pas un phénotype. En outre, l’homologue de souris endogène peut interférer avec la localisation de la protéine humaine exogène. La génération de modèles de souris knock-out dispose d’une solution à ce problème ; Cependant, c’est peut-être pas possible dans toutes les situations. Une autre approche consisterait à épuiser la protéine souris en injectant des Arni ou oligonucléotides morpholino conçu pour pas de cible l’exogène ARN et des protéines. Enfin, il est important de noter que tandis que beaucoup de protéines est homologues entre humain et de souris, des différences peuvent exister, ce qui conduit à des différences dans la localisation et la fonction qui pourrait empêcher ce type d’analyse interspécifique. Comme les outils de manipulation génétique comme Cas9-génome édition27 deviennent moins cher et plus banals, ce protocole pourrait évoluer dans la prise des lignées de souris knock-in, humanisé au lieu de dépendre de microinjection.\nCe travail a été soutenu par une subvention de recherche de l’American Society for Reproductive Medicine et du Charles et Johanna Busch Memorial Fund à l’Université Rutgers, The State University de NJ à K.S. est a été financée par une subvention de la N.I.H. (F31 HD0989597).


Phyllostachys Iridescens - Bambou Comestible - Rezo Plant\nAccueil / Bambous Traçants / Phyllostachys iridescens\nOriginaire de Chine, il croît dans les provinces côtières du Sud-Est, entourant Shanghaï. Ses chaumes sont verts et striés longitudinalement de jaune à la base (discret). Les cannes jaunissent avec le temps. Son feuillage est vert mat. Son port est érigé. A noter la coloration grise-bleue-blanche sous les noeuds.\nCatégorie : Bambous Traçants\nHauteur adulte : 7/13 m\nDiamètre de la canne : 6/7 cm\nCe bambou peut être planté en massif, c’est de cette manière qu’il se plaira le plus, voire en touffe isolée.\nSon introduction en Europe date de 1984. Ses jeunes turions sont comestibles. Son principal attrait vient de ses chaumes striés subtilement sur toute la longueur des entrenoeuds. Un très joli bambou, trop rare et trop peu utilisé. Un bambou un peu difficile mais magnifique une fois bien implanté. Pour collectionneurs.\nPhyllostachys aureosulcata “Alata”\nPhyllostachys aureosulcata “Aureocaulis”\nPhyllostachys atrovaginata “Green Perfume”


Men : Tie clip - Music Gifts : Jewelry - Musical Equipment - Free-scores.com\nMen : Tie clip\nBy Brands › Divers (5)› Musical Goods (3)› Fuzeau (1)› Libero (1)\nSELLER COUNTRIESUSAFRANCECANADAUNITED KINGDOMITALIASPAIN Amazon FRANCE (17)Note4Piano (4)\nSub-Departement (all)BraceletsBroochesCharmsCufflinksEarringsJewelry boxesMen : Pendants and o…Men : Tie clipNecklaces and Charms…OthersPiercingRings Brands (all)DiversFuzeauGold ToneLiberoMusical Goods Best sellersStock / Price low to highPrice low to highPrice high to lowCommentsStars notationsNew ReleasesA-Z Title\n[Pince à Cravate Saxophone ] / En métal argenté. Dimensions : 5 cm x 1.5 cm Livré sous coffret. / Pince à Cravate /\nGéné rique pince à cravate violin II\nviolon, grand. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile\nGéné rique pince à cravate line of music\nportée de notes. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile\n[Pince à Cravate Saxophone] / En métal doré. Dimensions : 5 cm x 1.5 cm Livré sous coffret. / Pince à Cravate /\nHomme -piano à queue, surréalistique. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile. Homme\nLindenmann Pince à Cravate, Trompete, 8032\n- Pince à Cravate LINDENMANN, Trompete, 8032\npiano à queue. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile\n- Magnifiquement détaillée les Paul guitare cravate fabriqué à partir d'un alliage de métaux polis - Cravate fermoir mesure 55 mm de long. Une grande attention au détail sur la guitare motif - Présenté dans une boîte cadeau ...(+)\n- Magnifiquement détaillée les Paul guitare cravate fabriqué à partir d'un alliage de métaux polis - Cravate fermoir mesure 55 mm de long. Une grande attention au détail sur la guitare motif - Présenté dans une boîte cadeau - Fender Stratocaster et kit tambour TIE diapositives également disponibles - Excellente idée cadeau pour les guitaristes, enseignant et fanatiques de guitare. Pour la gamme complète de la musique sur le thème des cadeaux, y compris les trousseaux de clés, badges, boutons de manchette et ouvre-bouteille, visitez notre boutique Amazon\nOnyx Art Barre à cravate pour homme Motif notes de musique Quaver\n- Pince à cravate pour homme. - Livré dans une boîte de présentation intelligente.\npiano de western saloon. métal rhodié, aux parts dorées, mat, au verso pince crocodile\nGéné rique pince à cravate e-guitar\nguitare électrique. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile\n[Pince à Cravate Portée de Notes] / En métal argenté. Dimensions : 5 cm x 0.9 cm Livré avec Pochon. / Pince à Cravate /\nGéné rique pince à cravate trumpet\ntrompette petite. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile\naccordéon. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile\nFormat : Largeur : 1,6 cm Longueur : 4,6 cm. BIJOU\nGéné rique pince à cravate saloon piano /2c\nHomme - piano de western saloon. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile\nGéné rique pince à cravate musical notes\nnotes musicales. métal rhodié, aux parts dorées, au verso pince crocodile\nclef musical sur bouton blanc. métal rhodié, imprimée, au verso pince crocodile\nDavid Van Hagen Pinces argent Treble Clef Ë Cravatese de


Telecharger [Mu] La Maison du Style (NDS) Gratuit\nNavigation on the site: Telecharger Tout » Jeux » Nintendo-DS » [Mu] La Maison du Style (NDS)\n[Mu] La Maison du Style (NDS)\nT�l�chargez le en 30 secondes !! .: La Maison du Style :. ?�diteur : NintendoD?�veloppeur : Syn SophiaType : Gestion / SimulationNote du test : 16/20 Note des joueurs : 17/20Date de sortie Fran?�aise : 23 octobre 2009 (23 octobre 2008 au Japon) Apr??s avoir fait un tabac au Japon, o?? il s'est ?�coul?� ?� pr??s d'un million d'exemplaires depuis sa sortie il y a tout juste un an, Style Savvy d?�barque chez nous sous le nom de La Maison du Style. Ne vous fiez ni ?� ce titre digne d'une ?�mission TV de M6, ni ?� la jaquette aust??re et snobinarde qui orne la bo?�te : ce jeu qui vous propose de g?�rer votre propre boutique de v??tements est un must-have (...) H?�bergeur : MegaUploadPlateforme : Nintendo DSFormat : NDSLangue : Fran?�aisSous-titres : AucunD?�coup?� avec : AucunTaille des fichiers : 256 Mo http://dd41e361.linkbucks.com OU[Mu] La Maison du Style (NDS) en Lien Direct usenet Inscrivez vous pour le t�l�charger\nT�l�charg�: 2441 fois | Commenter: 0 [Imprimer]


Warren Barguil, euphorique: "Je suis sur une autre planète" (VIDEOS) - La DH\nWarren Barguil, euphorique: "Je suis sur une autre planète" (VIDEOS)\nAFP Publié le jeudi 20 juillet 2017 à 18h44 - Mis à jour le jeudi 20 juillet 2017 à 21h54\nEdito: Froome attend sa première (VIDEO)\nLa question du jour: Warren Barguil va-t-il revenir l’an prochain comme leader ? (VIDEO)\nDécouvrez les réactions après la 18e étape.\nLe maillot à pois français Warren Barguil (Sunweb) s'est dit jeudi "sur une autre planète" après sa deuxième victoire d'étape sur le Tour de France en haut de l'Izoard.\n"J'ai toujours du mal à réaliser, pour moi c'est un rêve ces trois semaines de Tour. Je suis plus haut que les nuages, je crois que j'ai quitté la Terre là. Je suis sur une autre planète."\nVous avez su attaquer au bon moment...\n"Quand j'ai attaqué, je voyais que Contador était pas loin, je voulais essayer de gagner une place au général. Ensuite, j'ai pris mon tempo, je savais pas qui était devant. Quand j'ai rattrapé Tony (Gallopin), je pensais que j'étais en tête et j'ai vu qu'il y avait Atapuma devant. Je me suis remémoré le Tour de Suisse quand il était échappé et que j'avais fini deuxième derrière lui pour très peu de choses l'an passé. Je me suis dit 'Ça va pas se passer comme ça, faut vraiment que je le passe'. Je gagne, c'est exceptionnel. Battre les meilleurs en haut de l'Izoard, j'y aurais jamais pensé."\nQue voulait dire votre geste lors de votre victoire ?\n"Le geste, c'est pour mes grands-parents qui sont décédés. J'avais mes deux papis qui suivaient énormément le vélo et, pour moi, c'était la dédicace que j'avais pour eux. C'était un moment émouvant car je les oublie pas et j'ai vraiment pensé à eux en passant la ligne."\nQue ressentez-vous à l'idée d'arriver à Paris avec le maillot à pois ?\n"Être sur le podium à Paris avec ce maillot, c'est incroyable, c'est un rêve de gosse. Il me reste à pas tomber demain et, dans le chrono, je vais faire très attention. Je pense que je l'ai mérité et je vais même le porter chez moi, je pense."\nVous vous rendez-vous compte que vous allez changer de dimension ?\n"Après beaucoup de malchance, la chance tourne enfin. J'ai eu beaucoup de gros problèmes mais j'ai jamais rien lâché et, aujourd'hui, ça paie. Il y en a pas beaucoup qui savent ce que j'ai enduré. Je confirme que je ne suis pas un grand champion qui a gagné un grand Tour comme des Contador ou des Quintana mais je ne suis pas non un cycliste lambda. Je n'y croyais pas trop, y en a beaucoup qui ont cru en moi et qui m'ont dit 'avec la fraîcheur que tu as, sur le Tour, tu vas vraiment t'impressionner' et ouais je m'impressionne."\nDu coup, pensez-vous jouer le classement général l'année prochaine ?\n"Si je reviens au Tour l'année prochaine avec les mêmes jambes, je pense que le général c'est possible. Après, aller gagner, pour moi il y a encore une grosse marge. Faire dans les cinq premiers, j'ai toujours dit que c'était un de mes objectifs. Mais on va pas griller les étapes, on va savourer le moment présent et on parlera de l'année prochaine en temps voulu."\nQu'est-ce qui fait la force de votre équipe ?\n"Je pense qu'on est une équipe très soudée, c'est comme une famille, tout le monde travaille pour tout le monde. Michael (Matthews) pour moi, moi pour Michael. Entre le Giro et le Tour, cette année, c'est exceptionnel pour l'équipe."\nFroome: "J'ai fait le plus difficile"\nChris Froome a estimé avoir "fait le plus difficile" en gardant le maillot jaune au sortir de la 18e étape, la dernière de montagne dans le Tour de France 2017, jeudi, au col d'Izoard.\nEtes-vous satisfait du bilan même si vous n'avez pas gagné d'étape ?\n"Je suis content. Mes équipiers ont fait un très bon travail pour contrôler. Les AG2R ont mis la pression et on a essayé d'attaquer dans les 2-3 derniers kilomètres. Mais il était impossible de distancer Rigoberto Uran et Romain Bardet. Cette année, j'ai passé les Alpes sans problème. A mon avis, j'ai fait le plus difficile. Maintenant, il reste le contre-la-montre. Quant à la victoire d'étape, cela aurait été formidable si j'avais pu gagner au sommet du col le plus emblématique du Tour mais mon but est d'avoir le maillot jaune. Si j'arrive à Paris en jaune, je n'aurai aucun regret."\nIl semble que Mikel Landa, votre coéquipier, a le niveau pour prétendre gagner le Tour...\n"Je ne vais certainement pas dire le contraire. Il a connu une première semaine de Tour assez difficile car il avait le Giro derrière lui. Mais il est revenu en forme à temps, pour les étapes de montagne. On a vu dans un final aussi difficile que celui d'aujourd'hui qu'il a été capable de faire le tempo. Il a le moteur pour être parmi les grands, il peut certainement jouer le classement général à l'avenir."\nUran est-il votre principal rival en vue du contre-la-montre ?\n"Oui, sans aucun doute. 'Rigo' est la plus grande menace. Parmi les coureurs du classement général, il est le plus fort après moi dans le 'chrono'. Et il a seulement 29 secondes de retard."\nSerge Pauwels et Tiesj Benoot "contents" de leur Tour\nSerge Pauwels (Dimension Data) et Tiesj Benoot (Lotto Soudal) se sont une nouvelle fois montrés les meilleurs Belges en montagne en franchissant en 20e et 22e position la ligne d'arrivée de la 18e étape du Tour de France au sommet du Col d'Izoard. Les deux hommes ont tiré un bilan positif de leur trois semaines.\nDéjà à l'attaque mercredi, Pauwels s'est une nouvelle fois retrouvé dans la bonne échappée ce jeudi. "J'avais l'intention d'en faire partie. Le groupe de tête était trop grand mais je suis quand même parti à l'attaque. Parfois, c'est plus facile de rester avec les favoris. J'étais très fatigué en début d'étape car mes jambes étaient lourdes à cause d'hier. Je dois remercier mes équipiers Jaco Venter et Steve Cummings pour leur aide", a expliqué le Lierrois, 18e au général.\nMaintenant que les montagnes sont franchies, Pauwels peut juger avec satisfaction la prestation fournie au long des trois semaines. "Je suis très content de mon Tour. Je me suis très bien senti tout au long des trois semaines. La première semaine, je suis resté beaucoup dans les roues et j'ai eu du mal à me retenir car j'avais de bonnes jambes. Heureusement, j'ai bien pu montrer que mes jambes répondaient bien dans la dernière semaine."\nTiesj Benoot a lui aussi affiché sa bonne volonté ce jeudi mais a été bloqué par les crampes. "A la fin j'ai dû lutter contre les crampes et cela m'empêchait de bien pédaler".\nDébutant sur le Tour, le Gantois de 23 ans ne peut qu'être satisfait de sa prestation et de sa 19e place provisoire au classement général. "J'ai pu faire ce que je voulais faire donc je suis content. Je n'ai pas obtenu un grand résultat donc j'aimerais bien revenir l'an prochain pour faire mieux avec les mêmes ambitions que cette année. Si je suis dans un bon jour et que je me retrouve devant avec des coureurs qui ne sont pas trop forts en montagne, j'ai ma chance. Demain, il y a encore une possibilité pour moi et ça pourrait être intéressant."\nRigoberto Uran (COL/Cannondale), 5e de l'étape et 3e du général: "L'important est d'être devant, de ne pas perdre de temps. On a monté fort l'Izoard, c'était très dur mais ça s'est bien passé pour moi. On savait que ce serait compliqué. C'est difficile d'attaquer les Sky. Le contre-la-montre est très important. Il est assez difficile, en fin de Tour."\nMikel Landa (ESP/Sky), 6e de l'étape et 4e du général: "On avait étudié la possibilité que j'attaque, pour obliger Bardet à se dévoiler. J'ai pensé à la victoire d'étape mais il y avait encore deux coureurs devant. Après, Chris (Froome) m'a appelé et je l'ai attendu. La prochaine étape ? On va essayer de la passer le plus tranquillement possible."\nFabio Aru (ITA/Astana), 13e de l'étape et 5e du général: "Ma bronchite ? les problèmes physiques font partie du sport, il faut l'accepter. La cinquième place n'est pas à jeter aux orties mais, bien sûr, je voulais plus de ce Tour de France. Malgré la déception de ces deux dernières étapes, nous devons être satisfaits du travail accompli ces derniers mois. Il n'a pas été facile de revenir à un niveau élevé après ma blessure. J'ai donné mon meilleur, aussi pour les nombreux supporters qui sont venus m'encourager."\nDan Martin (IRL/Quick Step), 6e au classement général: "J'ai essayé de maintenir la pression sur Aru qui souffrait. Je voulais aussi voir si je pouvais distancer Froome et créer un trou, avant qu'il ne revienne. J'ai trouvé cela étrange que personne d'autre n'attaque, on aurait dit qu'ils voulaient protéger leurs places dans le classement général mais c'est leur décision. Pour ma part, j'ai tout donné et je suis heureux et fier d'être ici avant le week-end final. C'est une performance vu ma chute de la première semaine et l'abandon de plusieurs de mes coéquipiers."\nDarwin Atapuma (COL/UAE Emirates), 2e de l'étape: "J'imagine que toute la Colombie était paralysée pendant l'étape. Je suis content de ce que j'ai fait mais je rêvais d'offrir un triomphe à la Colombie le jour de notre fête (nationale) du 20 juillet. Cela n'a pas été possible mais on a essayé jusqu'à la fin. C'est quasiment une victoire".\nAlberto Contador (ESP/Trek), 10e au général: "J'ai eu de très mauvaises sensations toute la journée peut-être à cause de la lutte d'hier. Ce fut difficile, je n'avais pas les mêmes jambes qu'hier. C'est sûr que cela n'est pas le Tour que j'aurais souhaité mais je suis content d'avoir donné le maximum chaque jour".\nYsaline Bonaventure qualifiée pour le tableau final à Budapest après avoir sauvé deux balles de match (mise à jour)\nIsraël annonce la conclusion d'un contrat gazier "historique" avec l'Egypte (mise à jour)\nIrak: 27 combattants progouvernementaux tués dans un guet-apens de l'EI\nQue regarde-t-on ce soir à la télé ? Les programmes du 19 février


Accueil > Découpe Laser > Tutoriels : préparez votre fichier 2D\nPour découper ou graver un objet au laser, vous aurez besoin d'un fichier vectorisé. Il existe des règles simples et efficaces pour assurer que votre fichier soit lu pour la découpeuse laser. Les lignes-doublons et l'oubli de tenir compte du kerf peuvent considérablement réduire la qualité de la découpe ou gravure finale. Il est important de vérifier à deux fois le design lui-même pour éviter ce genre d'imperfections.\nPréparer votre fichier pour la Découpe Laser, en utilisant votre logiciel préféré.\nDans ce tutoriel, vous apprendrez à modéliser, corriger et exporter un fichier pour la Découpe Laser avec Illustrator : respecter le kerf, économiser de l'espace, exporter au bon format...\nDans ce tutoriel, vous apprendrez à modéliser, corriger et exporter un fichier pour la Découpe Laser avec SketchUp.\nDans ce tutoriel, vous apprendrez à corriger et exporter un fichier déjà modélisé, pour le préparer la Découpe Laser avec Illustrator : respecter le kerf, économiser de l'espace, exporter au bon format, éviter les lignes superposées...\nDans ce tutoriel, vous apprendrez à découper votre modèle 3D en pièces découpées au laser 2D, puis à les assembler en d'incroyables structures 3D.\nDans ce tutoriel, vous apprendrez à modéliser, corriger et exporter un fichier pour la Découpe Laser avec Fusion 360.\nTransférez un fichier 2D\nLes Matériaux de Découpe et Gravure Laser proposés par Sculpteo\nPrix, Livraison et Délais pour la Découpe et Gravure Laser avec Sculpteo\nTutoriels : Préparer vos fichiers pour l'Impression 3D


L'inconnu de la forêt de Coben - Cultura\nL' intrigue commence le 23 avril 2020 dans l'Etat du New Jersey . L'inconnu de la forêt se déroule simplement à l'approche des élections présidentielles américaines et met en scène un des candidats au pouvoir.\nRusty Eggers candidat ne fait pas l'unanimité, il prône une politique anarchique, on retrouve Hester Crimstein, avocate pénaliste , personnage secondaire et récurrentes dans les autres romans. Hester, veuve, âgée de plus de soixante-dix ans, sens mordant de la répartie, elle est aussi la mère de trois fils. L'un d'eux, David, est mort tragiquement dans un accident de voiture.\nEnfant, David avait un ami prétendument imaginaire, qui en réalité existait bel et bien et vivait dans la forêt voisine mais aussi dans les maisons inoccupées.\nEnfant, David avait un ami prétendument imaginaire, qui en réalité existait bel et bien et vivait dans la forêt voisine mais aussi dans les maisons inoccupées .\nIl sera surnommé Wilde, allusion subtile à sa nature sauvage, quand il sera retrouvé âgé de six à huit ans.\nRe: L'inconnu de la forêt d'Harlan Coben\nHmm, ça fait longtemps que j'ai lu un Harlan Coben... Celui-là pourrait me tenter...\nMerci pour votre post!!\n@soff78 , avez vous lu ne t'enfuis plus de l'auteur? si c'est le cas et que vous avez aimé celui-ci vous plaira !\nEnquêter sur les autres quand on ignore sa propre identité, Wilde doit pourtant s'y résoudre. Ayant vécu enfant seul dans les bois, il les connaît comme sa poche. Aujourd'hui, il doit rechercher une jeune fille dont la disparition inquiète bien peu de monde. Pourquoi ? Les parents comme les amis font semblant de ne pas avoir remarqué quoique ce soit d'étrange dans le comportement de la jeune fille. Bourreau des cœurs, Wilde ignore dans quoi il s'engage. Les menaces sont grandissantes, le scandale politique étant une des pistes explorées par l'enquêteur.\nThriller mystérieux où quête de soi et quête d'identité vont de pair avec la méfiance. Traitant de façon juste du harcèlement scolaire et de la psychologie adolescente, Harlan Coben nous montre à quel point les apparences sont trompeuses, même pour un enquêteur aussi aguerri et perspicace que Wilde. La confiance, autant dans les autres que dans nous-mêmes, peut mener bien loin.\nWilde vous attend ici sur Cultura.com\nLibraire au Cultura de Montivilliers\ninconnu de la forêt\nRe: L'inconnu de la forêt de Coben\nBonjour @Myriam-Montivil ! Merci pour ce coup de cœur ! Il existe déjà un avis sur le forum à propos de ce livre. Je me permets donc de déplacer le vôtre sous celui déjà existant afin que les lecteurs puissent profiter de vos deux avis. A très vite


Kilstett - Architecture rurale\nContrairement aux autres maisons françaises, les maisons alsaciennes étaient considérées comme étant des biens mobiliers.\nOn pouvait en effet les démonter et les remonter en numérotant et détachant les différentes poutres.\nParticularités des maisons de Kilstett\nVers le XVIIe siècle, les bâtisseurs de maisons alsaciennes devaient abattre une vingtaine de chênes pour faire les colombages d'une maison. Le saule têtard était élagué puis tressé pour renforcer le torchis.\nA Kilstett, les maisons alsaciennes étaient souvent petites car ses habitants étaient des ouvriers agricoles modestes qui y vivaient parfois à 15. Le Ried était une région moins riche que les autres.\nPour éviter de perdre de la chaleur, les plafonds étaient très bas et les fenêtres souvent petites.\nOn trouve sur les maisons alsaciennes des tuiles traditionnelles : le tuilier fabriquait des tuiles en forme de queue de castor ("bieberschwantz" en alsacien) à l'aide d'argile et d'eau. Il les faisait sécher dans un moule puis les faisait cuire pour les rendre plus solides.\nLe torchis est un mélange de boue, paille, argile, parfois même des crins de chevaux ou poils de vaches.\nDes branches de saule tressées (palançons) sont placées entre les poutres pour faire tenir le torchis.\nAujourd'hui, le saule est remplacé par des briques.\nLes maisons étaient souvent peintes en bleu, couleur de la Vierge Marie. Les habitants des maisons bleues étaient donc des catholiques.\nA l'époque, les villageois étaient très croyants et superstitieux, c'est pour cela que l'on trouve de nombreux symboles sur les maisons alsaciennes.\nCes symboles exprimaient un souhait, signalaient un métier ou servaient à se protéger contre l'orage, l'incendie, l'inondation, les forces occultes et maléfiques, le tremblement de terre,... On trouvait ces symboles à plusieurs endroits de la maison : sur les colombages, les tuiles, le poteau cornier, les allèges de fenêtres et les portails.\nLa date de construction de la maison est indiquée sur les poteaux d'angle ou corniers, précédée des initiales du nom de l'habitant. Le nombre 1 a de nombreuses variantes et a évolué à travers le temps. Il désigne aussi le signe de l'infini en espérant que la maison résistera au temps.\nEn vous promenant dans le village, vous pourrez observer différentes formes de colombages :\nla chaise curule (A) : symbole réservé aux personnes aisées, notables, qui ont une grande importance pour la vie du village\nla croix (B) : signe multiplicateur, symbole de l'union et du mariage\nle losange (C) : symbole de fécondité\nle losange barré (D) : symbole de la force\nl'étoile : signifie la force de l'homme\nle disque solaire (E) : symbole solaire (signe de vie)\nle demi man (F) : signifie l'homme et le Christ\nLa tuile comporte également des symboles de protection divine. Une coutume consistait à poser une tuile décorée sur le toit : la tuile portait généralement la date de construction de la maison, des symboles chrétiens ou païens (comme les étoiles, les arbres de vie, les empreintes de bébé,...) imprimés dans l'argile encore molle des terres non cuites.


Faire l amour sexy, dessin animé xxx porno, action vérité hot en ligne\ncjmillerbooks.com Telecharger gratuitement film x Massage sexuel narbonne Chatte en gros plan Faire jouir une femme clitoridienne Regarder video porno gratuitement Jeu de sex fr Amour mere et fille\nFaire de l'amour avec ma belle milf gf Carrie Brooks se fait lécher sur le lit. Plug anal creux. Louis Garrel est toujours aussi sexy avec son faux-air de blasé et on se dit en le voyant qu'on se ferait bien un petit parisien.\nNikky dream s'enflamme de tendresse. Faire l amour sexy. Cette cougar explique tout à une jeunette. Je le remarque car la drague est difficile. Video de sexe extrait xxx. Sweet couple rend passion sexe Dans Reviens-moi , elle est face à un James McAvoy aussi mystérieux que séduisant. Bonne visite dans ce petit paradis de la branlette: Baise très exitante avec Capri Cavanni!\nUn salon de massage très particulier. Les positions et endroits auxquels vous pensez: Parce qu'on a toutes ressenti à un moment donné des sentiments ambigus pour notre meilleur ami. La jeune fille ne comprend pas la vision du jeune homme et se montre de plus en plus intriguée par lui.\nParce que l'amour "vanille" c'est bien sympa, mais faire l'amour bestialement c'est souvent plus excitant.\nSexy Life Sexy Girl: Les couples glamour font l'amour et le hardcore Suite à un problème technique dans un avion, les stewards droguent les passagers qui finissent par se laisser parler tous leurs désirs. Sexe avec gros penis. Deux femmes d'âge mûr faire l'amour Indian Sexy prend It Deep et Slow Couple ébène ayant un amour intime Making Dans Un jour, Anne Hathaway est folle amoureuse de son meilleur ami Dexter mais elle n'ose jamais lui avouer car elle sait que c'est un dragueur confirmé.\nCependant, il arrive que l'on se laisse aller à nos pulsions et on doit vite décider si on veut en rester là ou aller plus loin. Les parents de Zahira, quant eux, n'ont aucune intention de lui donner voix au chapitre. Les heurs et malheurs d'une famille chinoise issue de la première génération d'immigrants taïwanais aux Etats-Unis dans les années Ce film a définitivement changé notre point de vue sur les bibliothèques.\nCette grosse salope baise apres le bain. Faire l amour sexy. Voici comment le sauver en 4 étapes Les 5 sujets à éviter avec un homme La méthode pour récupérer un homme et reconquérir son coeur.\nElle songe au mariage, mais le jeune homme préfère qu'elle avorte. Que vous connaissiez bien ou peu la nana, vous DEVEZ vous faire confiance mais aussi établir des échanges basés sur un rapport donnant-donnant.\nConvaincre une inconnue à faire l'amour c'est plus difficile que de faire l'amour le premier soir. Un beau jour, Boule, un garçonnet en visite avec son père et sa mère, s'arrête devant la niche de l'animal. Il faut dire que la formule est parfaite! Lorsque vous la sentez aussi excitée que vous, envoyez-lui une photo de votre entre-jambe qui laisse apparaître votre érection sous votre pantalon et dites-lui: Couple amateur amour romantique sexy faire 7: Cher Kamal… à quel époque sommes-nous rendu pour se séduire par SMS.\nCe jeune couple sexy nous offre une séance de sexe certes explicite, mais non moins sensuelle et érotique. Le désert de Thar n'a rien à envier au Sahara.\nSéquence très sexy dans "L'amour est dans le pré".\ncjmillerbooks.com © 2013-2017 Faire l amour sexy.


Douce angélique – L'Herboriste\nPublié le 17 septembre 2017 19 septembre 2017 par Françoise Tassenoy\n« Si cette plante, avait le mérite d’être étrangère, elle serait aussi précieuse pour nous que le Ginseng l’est chez les Chinois; elle se vendrait au poids de l’or » (Bodart 1810)\nAujourd’hui oubliée de nos jardins et de notre boîte de soins, l’Angélique ou Angelica archangelica à l’odeur musquée et aromatique a constitué à elle seule une panacée aux temps modernes, en particulier lors des grandes épidémies. On raconte qu’en France, quatre bandits ayant concocté une potion à base de plantes médicinales et notamment d’angélique s’en aspergeaient le corps et les mains. Cette décoction, encore appelée de nos jours le vinaigre des quatre voleurs, leur permettait de se prémunir de la peste et de détrousser plus facilement leurs malheureuses victimes.\nEn 1510, Paracelse, un célèbre médecin de l’époque confirme son importance dans la lutte contre le fléau qui a ravagé alors la ville de Milan. Acquise en des temps bien sombres, la réputation de l’angélique lui permit à la fois d’obtenir une belle place dans les jardins des monastères et auprès des médecins de l’époque comme d’être surnommée l’Herbe aux anges ou l’Herbe du Saint-Esprit. La tradition populaire véhiculait alors que l’archange Gabriel en personne révéla ses propriétés à un ermite.\nMais la célébrité a des hauts et des bas: elle fut bientôt détrônée avec la découverte des nouveaux mondes par ses consœurs exotiques comme le ginseng. Cette comparaison est d’ailleurs largement justifiée tant l’angélique se retrouve dans nombre de recettes aphrodisiaques.\nElle revient néanmoins par à coups dans les remèdes médicinaux. Ainsi, J.-F. Cazin (XIXième siècle) indique qu’en 1759, un Niçois du nom de Annibal Camoux mourut à l’âge de 121 ans et trois mois. Sa longévité serait dûe aux racines d’angélique qu’il suçait quotidiennement (Divine Angélique, Bernard Bertrand, Editions de Terran).\nL’angélique possède de réelles propriétés antibactériennes, apéritives, sédatives, diurétiques, expectorantes, antiseptiques, antimicrobiennes, antispasmodiques, emménagogues…\nElle est à la fois utilisée en cas d’anémie, d’appétit insuffisant, de digestion, d’insomnies, de migraines, de palpitations, de troubles ORL, de règles douloureuses,… Elle peut venir à bout de certains problèmes de peau et s’utilise en décoction en rinçage après un shampoing pour fortifier les cheveux.\nLa plante entière peut être consommée: graines, semences, feuilles, tiges et inflorescences. Néanmoins, contrairement à la plupart des plantes médicinales dont les vertus s’expriment par la dessiccation, les feuilles et fleurs d’angélique perd ses vertus une fois séchées. Raison de plus pour en planter chez soi si on en a l’occasion…\nAu niveau des principes actifs, la plante est constituée de tanins, flavonoïdes, d’huile essentielle (citronellol, limonène, terpinéol), de résine et de coumarines. Les coumarines de l’angélique révèlent la toxicité de la plante une fois exposée à la lumière. Des orties à ses pieds favoriseront la production d’huile essentielle. Attention enfin à ne pas manipuler le suc des tiges qui peuvent occasionner des inflammations de l’épiderme. En d’autres mots, elle est photosensible et provoque des allergies et brûlures au contact de la peau.\nSi l’angélique a perdu aujourd’hui ses lettres de noblesse, c’est en partie parce qu’elle a disparu des paysages sauvages. C’est bien dommage car elle mériterait à regagner nos cœurs d’autant que son allure – une taille pouvant atteindre 2 à 3 mètres et de belles inflorescences à l’odeur de miel qui durent tout l’été – ne manque pas de charme dans un jardin. La plante vit de deux à quatre ans et meurt après la première floraison. Les racines peuvent atteindre l’épaisseur d’un bras et sont gorgées d’un suc laiteux. La plante est propre à l’Europe du Nord – du Groenland et de de la Scandinavie jusqu’aux montagnes de l’Europe centrale et à la Russie moyenne – et est cultivée dans nos contrées. Il faut chercher plus que d’habitude pour trouver des plants d’angélique officinale. Bon, évidemment, le goût amer de l’angélique, utilisé seul, peut également facilement rebuter le plus téméraire…\nCet abandon n’est néanmoins pas généralisé à toute l’Europe. En Suède, l’angélique est largement utilisée en pharmacie, elle est également utilisée confite sur les gâteaux de Noël. Les Lapons en mâchent la racine en guise de tabac. En Asie, les espèces d’angélique spécifiques sont également largement utilisées en particulier pour ses propriétés apéritive, digestive et tonique. Au Tibet, l’angélique entre dans la composition d’une mixture aphrodisiaque associant la Mauve, la Cardamome, l’Asperge, la Belle de nuit et la Renouée. En Amérique, les chamans amérindiens se gargarisaient avec une décoction de tige pour entreprendre leurs chants cérémoniels.\nL’angélique est souvent associée dans la manufacture de liqueurs en association avec la sauge, l’achillée, la gentiane,… pour ses propriétés sédative et tonique. Elle est d’ailleurs recommandée aux convalescents, aux personnes souffrant de nervosité ou pour les soucis digestifs.\nPour terminer, voici quelques recettes à faire soi-même pour terminer et vous convaincre définitivement de faire entrer à nouveau cette plante jadis populaire et aux mille vertus, que ce soit dans votre jardin, dans votre assiette ou dans votre tasse ….?\nUne liqueur bénéficiant des mêmes vertus que les tisanes et infusions: laisser macérer 4 ou 5 jours 30 g de racine d’angélique dans deux litres de bon cognac et 30 g d’amandes amères mondées et réduites en pâte. Passer ensuite la macération dans un linge et y ajouter 1 litre de sucre. Enfin, filtrer et conserver en flacons\n(Recette de Y. Trouard Riolle dans Divine Angélique, Bernard Bertrand, Editions de Terran)\nCe bain est à la fois relaxant et fortifiant: faire infuser 500g de feuilles fraîches d’angélique dans deux ou trois litres d’eau bouillante.\nSi vous n’avez pas la possibilité de profiter du ‘frais’, faites une décoction avec 250 g de racines séchées dans deux litres d’eau, filtrer au dernier moment et ajouter à l’eau du bain.\nMettre 200 g de racines fraîches coupées en tronçons dans un litre d’huile de germe de blé. Faire macérer au soleil pendant trois semaines avant de filtrer et de conserver dans un flacon hermétique. Utiliser le soir en massage relaxant ou pour calmer des douleurs musculaires.\nAssocier 40 g de racines d’angélique, 20 de ginseng , 20 g de feuilles de pissenlit et 20 g de feuilles d’ortie et faire infuser le tout pendant 20 minutes.\nAlcool d’angélique digestif\nFaire macérer 40 g de racines d’angélique et des grains de genièvre dans un litre de vin rouge pendant 10 jours. Ajouter un sirop réalisé à partir de 400 g de sucre et un demi-litre d’eau puis faire à nouveau macérer pendant 15 jours. Après filtration, à conserver dans des bouteilles hermétiques. Un verre par jour avant les repas.\nLuttez contre les soucis digestifs en préparant une décoction de fenouil et d’angélique : dans une casserole, mettre 30 cl d’eau froide, ajoutez 2 cuillerées à soupe de racines sèches ou de graines d’angélique et 1 cuillerée à soupe de graines de fenouil. Porter à ébullition 5 minutes et infuser hors du feu 1/4 d’heure (sous un couvercle). Filtrez et buvez après votre repas.\nArticle précédentPrécédent Petit lexique des propriétés des plantes\nArticle suivantSuivant Sept remèdes-maison pour les peaux sèches


PRIME DE NOEL date et montant du versement par pole emploi et la CAF – PROMOTIONS SOLDES\nPRIME DE NOEL date et montant du versement par pole emploi et la CAF\nPRIME DE NOEL 2013 : date de versement\nLa date de versement de la prime de Noël devrait être prochainement annoncée par le gouvernement de Jean-Marc Ayrault et de François Hollande. Cette prime exceptionnelle de fin d’année et qui est versée par la CAF pour les français les plus démunis, est assimilée à une prestation sociale. C’est en 1988 que cette prime de Noël a été instaurée pour la première fois.\nPRIME DE NOEL 2013 ; qui peut la toucher ?\nEn premier lieu, la prime de Noël 2013 sera versée aux bénéficiaires du RSA socle, encore appelé revenu de solidarité active, mais également aux personnes bénéficiant de l’Allocation de Solidarité Spécifique ASS. Par contre, les bénéficiaires du RSA activité ne pourront pas toucher cette prime de Noel 2013. En principe, pour toucher la prime de Noel 2013, aucune démarche particulière n’est à réaliser. Cette prime est versée de manière automatique à votre banque ou sur votre compte chèque de la Banque Postale.Ateetion toutefois, car suivant que vous habitez Lille, Lyon Paris ou Marseille, la date de versement de la prime de Noêl ne sera pas la même. En effet, tout dépend de la CAF dont vous dépendez, mais en tout état de cause, cette allocation vous sera versée avant la date fatidique de Noël.\nPRIME DE NOÊL 2013 : quels est le montant ?\nPour cette année 2013, le montant de la prime de Noël est variable en fonction de votre situation de famille. A titre d’exemple, pour un célibataire sans enfant devrait toucher un montant de 152,45 €. Les personnes inscrites à Pôle emploi et n’étant pas en retard de leur actualisation, devraient voir le virement bancaire effectué par la CAF avant le 20 décembre 2013. Pour avoir le montant exact de la prime de Noël 2013, vous pouvez consulter le site officiel de la CAF (Caisse d’Allocation Familiales).\nPublié dans Non classé et étiqueté PRIME DE NOEL le 11 septembre 2016 par promotionsoldes.\tLaisser un commentaire\n← Centre des impôts LILLE – horaire, adresse et téléphone\tCREDIT REVOLVING EN LIGNE et CREDIT BANCAIRE comment solder son crédit (surrendettement) →


Kosovo : pas de libéralisation des visas avant 2020 ? L'opposition se rebiffe - Le Courrier des Balkans\n> Kosovo : pas de libéralisation des visas avant 2020 ? (...)\nJohannes Hahn était lundi en visite entre Belgrade et Pristina pour favoriser une sortie de crise, il en a créé une nouvelle. L’opposition kosovare réclame la démission du Premier ministre Ramush Haradinaj et tous ceux qui ont promis l’abolition du régime des visas en 2018 en l’échange de la ratification de la nouvelle frontière avec le Monténégro.\n(Avec Birn) - La Ligue démocratique du Kosovo (LDK), plus grand groupe de l’opposition au Parlement, a réclamé mardi la démission du Premier ministre Ramush Haradinaj et du vice-Premier ministre Fatmir Limaj. La veille, le Commissaire européen à l’élargissement, Johannes Hahn, en visite à Pristina, avait déclaré que la suppression des visas Schengen pour les ressortissants du Kosovo aurait lieu en 2020, au lieu de 2018 comme promis. La LDK accuse le Premier ministre et Fatmir Limaj d’avoir entravé « par la violence et l’intrigue » la levée des visas. Une allusion à l’époque où les deux hommes, alors dans l’opposition, protestaient contre la nouvelle (...)


Les meilleurs goodies et objets publicitaires à Lesneven (29260) | Krokrodeal\nAccueil > Bretagne > Finistère (29) > Lesneven (29260)\nLes objets publicitaires à Lesneven\nQuels sont les goodies personnalisés les plus populaires à Lesneven ?\nLes entreprises aux alentours de Lesneven (29260) font régulièrement appel à krokrodeal pour leurs communication par l'objet : lancement de produit, salons professionnels ou évènements, conférence, cadeaux d'entreprise ou goodies pour leurs clients). Les gadgets personnalisés les plus plébiscités sont :\nQuel est l'environnement économique de Lesneven ?\nLesneven est la 22ème ville la plus peuplée du département Finistère (29) avec près de 7,083 habitants. La commune s'étend sur 10.27km2 entre 14m et 79m d'altitude. La densité moyenne de population est de 690 habitants/km2.\nL'activité économique est très dynamique avec 1,031 entreprises enregistrées à Lesneven (au 19ème rang du département) dont 78 nouvelles créations en 2019.\nLa croissance nette du nombre d'entreprises en 2019 (différence entre les immatriculations de société et les cessations d'activité) est de 41 nouvelles entreprises. Ce qui fait de Lesneven, la 17ème ville la plus dynamique du département Finistère en terme de création d'entreprise en 2019.\n25.3% des entreprises de Lesneven (29260) emploient au moins un(e) salarié(e).\nQuel fournisseur d'objets publicitaires choisir à proximité de Lesneven ?\nPourquoi choisir Krokrodeal pour vos objets promotionnels à Lesneven ?\nAttirez de nouveaux prospects ou fidélisez votre clientèle dans les villes les plus proches de Lesneven telles que :


Épicure vous révèle ses secrets pour être (encore plus) heureu... - Biba\nÉpicure vous révèle ses secrets pour être (encore plus) heureuses\nPar Julie Reynié Le 23 mai 2014 à 16h10\nApprendre à se faire plaisir mais pas n'importe comment.\nLe bonheur est universel. Alors, afin de piquer de nouveaux conseils pour être encore plus "happy", on est allées papoter avec Épicure, un célèbre philosophe né il y a plus de 2300 ans. On vous rapporte notre conversation (fictive) :\nBiba : Dis Épicure, c'est quoi être heureux ?\nÉpicure : C'est tout simple ! Être heureux, c'est éliminer tout source de souffrance. Voilà tout.\nOk... On a l'impression que c'est facile, à t'écouter... Tu peux nous dire ce que c'est, ces sources de souffrance ?\nIl s'agit des des plus grandes peurs de l'homme, c'est-à-dire celle des dieux et celle de la mort. Bon, à votre époque, la peur des dieux, qui peuvent vous punir ou gérer vos vies à votre place, est un peu moins forte. Mais si vous croyez à une vie future, gardez en tête que les dieux sont -par définition- parfaits. Donc, ils ne peuvent donc pas se montrer cruels et vous n'avez aucune raison de vous inquiéter !\nEn ce qui concerne la peur de la mort, il est tout aussi facile de s'en débarrasser ! Pourquoi avoir peur de mourir alors que la mort, par définition, c'est la privation de sensation? Or, tout bien - et tout mal - est dans la sensation. Au contraire, cette idée doit nous booster, nous faire prendre conscience de notre mortalité pour vivre la vie, encore plus à fond.\nOk, je vois ! Être heureux, c'est donc - un peu- ne plus avoir peur du futur, selon toi !\nOui, et pas qu'un peu ! En fait, le secret, c'est vivre dans le présent, tout simplement. De toute façon, ça ne sert à rien de s'angoisser pour le futur, vu qu'il n'est pas arrivé, ou de souffrir du passé, vu qu'il est...passé, justement. Donc on respire et on vit pleinement l'instant, car le présent seul est le temps du pur bonheur d'exister.\nEt comment on fait pour mieux profiter du moment présent, justement, Épicure ?\nBen, on se fait plaisir...mais pas n'importe comment. On pense souvent que l'épicurisme, c'est se lâcher, mais c'est totalement faux! En fait, il existe clairement 3 sortes de désirs, à bien distinguer et à bien trier :\n1. Les désirs naturels et nécessaires, comme se nourrir, dormir,... Misez sur ceux-là, ce sont des valeurs sûres, puisque vous êtes obligés de les faire. Donc on arrête de faire gargouiller son ventre à coups de régimes inutiles, hein ?!\n2. Les désirs naturels mais non nécessaire, comme manger des plats trop réfléchis, avoir des rapports sexuels toujours plus intenses, des maisons toujours plus belles pour s'abriter, s'habiller avec des fringues toujours plus chics... Le problème de ces désirs-là, c'est qu'on en veut toujours plus ! C'est une quête sans fin ! Donc soyez conscients de ce que vous avez déjà, c'est déjà très bien, et souriez.\n3. Les désirs non naturels et non nécessaires. Franchement, est-ce que vous avez VRAIMENT besoin à chaque fois du nouveau modèle de smatphone, hum ?\nUn peu dur quand même, Épicure ! Nous, on adore manger du chocolat et s'acheter de nouvelles fringues...\nEt bien faites-le ! Tout est dans la modération. Se faire plaisir en shoppant une nouvelle robe, c'est bien. Mais qu'avoir de nouvelles tenues devienne un but en soi, c'est tue-bonheur.\nMais quand-même, Épicure, tout n'est pas si simple ! Parfois, les choses de la vie font qu'on peut stresser, souffrir,...\nEvidemment ! Mais le mal, même s'il est grand, est toujours surmontable. Pour y arriver, vous devez d'abord vous concentrer sur le présent et sur ce qu'il a de bon. Pour vous aidez à vous "muscler" ce muscle du bonheur présent, n'hésitez pas à vous retirer dans votre "jardin intérieur", c'est-à-dire à méditer.\nEnsuite, jouez avec votre imagination ! Elle vous fait envisager les pires scénarios ? Contrôlez-la en lui montrant que ça ne sert à rien d'imaginer les événements futurs - vous n'êtes pas devins, non ? Et si, au contraire, votre raison a de quoi se prendre le chou, faites comme Peter Pan : accrochez-vous à une pensée agréable, qu'il s'agisse d'un souvenir heureux ou d'un futur serein. D'ailleurs, en vous accrochant à cette dernière pensée, elle se réalisera.\nOn a compris ton message, merci Épicure !\nAvec plaisir ! Et passez une belle journée !


Commençons par le commencement - Le Récit\nLa sagesse commence avec une compréhension de Dieu (qui il est et comment il répond au monde autour de nous). En Jésus, nous avons l’exemple parfait de qui est Dieu. Voir le monde au travers des yeux de Dieu nous oblige à le connaître personnellement au travers de son Fils. Nous pouvons faire cela en ayant une relation vivante avec Jésus et en lisant la Bible.\nIl y a plusieurs façons d’interagir avec le monde autour de nous. Il existe des personnes sages et d’autres stupides. Notre monde nous bombarde continuellement d’idées pour réussir dans la vie. Dieu nous dit de le chercher premièrement et les besoins réels de la vie suivront (Matthieu 6 :33). C’est seulement en voyant notre monde comme Dieu le voit que nous prendrons de sages décisions et que nous agirons de manière responsable. Nous aurons alors un impact positif. Si nous suivons «la sagesse» qui ne reflète pas les valeurs du royaume de Dieu, nous nous dirigeons vers un désastre.\nDieu, Toi seul est vraiment sage. Aide-moi à te comprendre en suivant ton Fils Jésus. Montre-moi le monde que tu as créé au-travers de tes lentilles afin que je puisse prendre de bonnes décisions qui te plairont et qui positionneront le monde à une meilleure place. Aide-moi à discerner entre ce qui est sage et ce qui est stupide; ce qui sera une bénédiction pour les autres et ce qui causera la destruction. Montre-moi la différence entre ce qui vient de toi et ce qui est un produit de ma nature déchue car je veux prendre de bonnes décisions. Entends ma prière, au nom de Jésus. Amen.\ndisciple, succès, valeurs


Harry et les trois reliques - Time Zone - Escape Game à Perpignan\nDans le monde de la Magie, une légende raconte le pouvoir de trois objets, plus connus sous le nom de "Reliques de la mort". Il se dit que le sorcier ayant en sa possession la cape d'invisibilité, la pierre de résurrection et la baguette de sureau serait un être invincible... Il serait le maître de la mort.\nLe dernier sorcier ayant détenu ces 3 reliques, était un des plus puissant de ce monde, il était connu sous le nom d’Aldus Doumbeldore. Alors que « celui dont on ne doit pas prononcer le nom » a fait son grand retour dans l’unique but de se venger, une lutte finale s’engage aux portes du Château: Harry est appelé à combattre dans la forêt interdite. Peu avant sa mort, Doumbeldore avait confié une ultime mission à l’Ordre du Phoenix pour aider Harry... Vous faites partie de cet Ordre, et il ne vous restera qu’une heure pour accomplir cette mission : mettre la main sur les 3 reliques, les ramener à Harry avant qu'il ne parte dans la forêt afin qu'il puisse détruire l'Horcruxe qui est en lui, tout en restant en vie, et ainsi anéantir celui dont on ne doit pas prononcer le nom à tout jamais.\n78 Avenue de Grande-Bretagne, 66000 Perpignan\n26 escapes réalisés 26 escapes notés 5 avis détaillés 2 avis utiles\nAvis posté le 11 avril 2022, salle jouée le 11 avril 2022 Nouveau\nTrès fluide, les décors rappellent les différents lieux du film, les manipulations sont bien pensées.\nLes difficultés ne sont pas insurmontables !\n2 escapes réalisés 2 escapes notés 2 avis détaillés\nSuper accueil, décors et énigmes au top comme l'exorcisme !\nMon premier escape game et pour moi le meilleur que j'ai pu faire et de loin.\nEtant fan de la saga Harry Potter j'y suis aller sans vraiment connaitre le concept. Depuis, grâce à Timezone nous sommes de vrai addict aux escape games.\nLes énigmes, les décors , les mécanismes sont incroyable et toute en rapport avec la saga.\nAllez y sans hésitez même si vous n'êtes pas fan des films vous allez adorer !\nAlors qu’Harry va engager le combat contre « celui dont on ne doit pas prononcer le nom vu qu’on n’a pas la licence officielle », nous devons explorer les locaux de Poudlard à la recherche de trois reliques qui elles seules lui permettront de l’emporter.\nNous avons à faire à une salle d’un niveau accessible se destinant en priorité à un public familial. La seule difficulté que pourraient rencontrer les équipes expérimentées serait de se mettre à chercher trop compliqué. La salle, très linéaire et avec une pièce de départ faisant office de hub central, est avant tout basée sur l’observation. Elle comporte de très nombreuses manipulations fun et ludiques. Beaucoup de ces dernières rendent obligatoire collaboration, jeu d’équipe et communication. La fouille est très peu présente.\nLes ... Voir plus\nAvis posté le 1 février 2022, salle jouée le 31 janvier 2022\nUn voyage extraordinaire et magique 🤩 tout était super 👍 bravo à l’équipe pour cette salle c’est un vrai bijou !\nDiane, Auré et 3 autres\nYan, Adrien et 1 autre\nJulie et Megane


Avis de décès : Mme Georgette De Villers (St-Amand) (1923- - 2014-12-14)\nAu Centre d'hébergement de Charlesbourg, le 14 décembre 2014, à l'âge de 91 ans et 1 mois, est décédée dame Georgette De Villers, épouse de monsieur Emile St-Amand, fille de feu madame Celina Gelineau et de feu monsieur Charles De Villers. Elle demeurait à Québec.\nle vendredi 19 décembre 2014, de 13 h à 16 h, de 18 h à 21 h et le samedi 20 décembre 2014, de 9 h à 10 h 30. Le service religieux sera célébré le samedi 20 décembre 2014 à 11 h en l'église St-Rodrigue (4760, 1e Avenue, Québec). L'inhumation se fera au cimetière St-Charles.\nOutre son époux, Émile St-Amand, elle laisse dans le deuil ses enfants : Diane (Renaud Thibault), Jean (Francine Renaud), Jocelyne et André; ses petits-enfants : Éric (Mélanie Déry), Mélanie (Sébastien Mercier), Jimmy (Véronique Ovando), Steven et Chantal (Jean-Laurent Savard); ses arrière-petits-enfants : Christopher, Yohan, Marika, Rose et Jacob. Elle laisse également dans le deuil de nombreux neveux et nièces, parents et amis.\nUn remerciement spécial de la part de la famille à tous les membres du personnel de l'équipe de soins palliatifs du Centre d'Hébergement de Charlesbourg pour les bons soins prodigués.\nMme Georgette a été longtemps membre de la Société St-Jean Baptiste et présidente du conseil local St-Rodrigue. Elle a également porté le titre de secrétaire et présidente générale de la Société St-Jean Baptiste de Québec.\nSon époux, Émile St-Amand, est le fils de Joseph-Henri-Ludger St-Amand et de Marie-Louise-Angelin Vachon; le petit-fils de Ludger St-Amand et d'Amanda Marticotte; l'arrière-petit-fils de Damase St-Amand et de Florence Petit. Émile est un descendant de Mathurin Robert dit St-Amant.


Dr. J. Guffens - Toutes les infos sur le stationnement\nBoomgaardstraat 173, 2018 Antwerpen, België\nStationnement à proximité immédiate - Dr. J. Guffens\nClique ici pour consulter la carte interactive de stationnement - Dr. J. Guffens - Anvers\nCette page vous aidera à vous garer facilement à proximité de votre destination - Dr. J. Guffens. Elle vous informe des emplacements de parking gratuits, à disque ou payants ainsi que les tarifs et horaires respectifs. La carte interactive ci-dessus vous permet de trouver rapidement les parkings gratuits, pas chers ou les plus avantageux à Anvers. Pour plus d'informations sur le parking à Anvers, cliquez ici.\nDr. J. Guffens se situe dans une zone de stationnement payante. Cette zone est indiquée en orange pointillée sur la carte ci-dessus. Voici les détails de la réglementation de la zone de stationnement :\nBerchem Station est situé juste à côté du Dr. J. Guffens. Il se situe à Burgemeester E. Ryckaertsplein 2, 2600 Antwerpen. Voici les détails de celui-ci :