Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing - PDF\nSaggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing\nDownload "Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing"\n1 PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO N. di catalogo DX : 6 corse, fino a 48 campioni per kit Uso previsto Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina è un sistema diagnostico in vitro per il sequenziamento mirato che risequenzia le regioni di codifica delle proteine e i limiti introne/esone del gene regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) in DNA genomico isolato da campioni di sangue intero periferico umano raccolto in K 2 EDTA. Il test rileva le varianti di singolo nucleotide e Indel piccoli nella regione sequenziata e inoltre referta su due mutazioni introniche profonde e due delezioni ampie. Il test deve essere usato sullo strumento Illumina MiSeqDx. Questo test è previsto per contribuire alla diagnosi in individui con sospetta fibrosi cistica (CF). Questo saggio è più appropriato quando il paziente presenta una fibrosi cistica atipica o non classica o quando altri pannelli di mutazioni non sono riusciti a identificare entrambe le mutazioni causanti la malattia. I risultati del test devono essere interpretati da un gruppo di genetisti molecolari certificati o da un esperto equivalente e devono essere usati assieme ad altre informazioni inclusi sintomi clinici, altri test diagnostici e anamnesi familiare. Questo test non è indicato per indipendente diagnosi neonatale, diagnosi prenatale, analisi pre-impianto, screening del portatore, screening dei neonati o screening della popolazione. Riassunto e spiegazione del saggio Descrizione clinica La fibrosi cistica (CF) è una delle malattie genetiche più comuni nel mondo occidentale ed è la malattia autosomica recessiva potenzialmente letale più comune nella popolazione bianca non ispanica 1-5. La fibrosi cistica incide sulla viscosità delle secrezioni mucose e influenza l'epitelio del tratto respiratorio, del pancreas, dell'intestino, del sistema epatobiliare, del tratto genitale maschile nonché le ghiandole sudoripare causando una complessa patologia multisistemica e multiorgano 2-4 nella quale i polmoni sono il sistema d'organi principalmente associato a morbilità e mortalità 6. In molti casi, un declino nutrizionale preannuncia una progressione della malattia polmonare dovuta alla fibrosi cistica; pertanto, un elemento fondamentale delle attuali strategie di intervento è la diagnosi precoce tramite screening neonatale 5, che favorisce un accesso tempestivo ai servizi medici fondamentali e consente di ottenere il miglior risultato possibile per gli individui affetti dalla patologia 2,5. Benché vi siano differenze tra i sessi per quanto riguarda la sopravvivenza e venga riferita una sopravvivenza mediana superiore per gli uomini rispetto alle donne, negli Stati Uniti la sopravvivenza mediana generale è di 38,3 anni 6. Varianti del gene CFTR e incidenza Il gene regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) identificato nel 1989 si trova sul braccio lungo del cromosoma 7 e contiene 27 esoni codificanti distribuiti su oltre 230 kb 2. Un mrna di 6,5 kb prodotto dall'allele normale codifica il gene CFTR, una proteina integrale di aminoacidi situata sulla membrana che funziona come canale di cloro regolato nelle cellule epiteliali di più organi 2,3. Attualmente sono state descritte oltre varianti del gene CFTR. Per la maggior parte si tratta di mutazioni puntiformi 7. La del gene CFTR più comune è l'allele F508del 3, che rappresenta quasi il 70% di tutte le varianti del gene CFTR 1. Tuttavia altre varianti comuni del gene CFTR spesso determinano un fenotipo CF e altre patologie correlate a CFTR 1-3. Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 1\n2 La fibrosi cistica ha un'incidenza di malattia stimata pari a un caso ogni nati vivi e una prevalenza di circa individui nella popolazione statunitense 2. Si verifica in tutte le etnie e razze con frequenze diverse: un caso ogni caucasici, un caso ogni ispano-americani, un caso ogni nativi americani, un caso ogni afroamericani, e un caso ogni asioamericani 2,4. Tuttavia, l'associazione tra un'etnia e un individuo interessato sta diventando sempre più difficile 8. La Tabella 1 fornisce le stime attuali della frequenza dei portatori della mutazione del gene CFTR in base all'etnia negli Stati Uniti, basate su una coorte di individui testati per il portatore senza anamnesi familiare di fibrosi cistica. Tabella 1 Frequenza generale del portatore della mutazione della fibrosi cistica in diversi gruppi etnici negli Stati Uniti 9 Gruppo etnico Frequenza del portatore osservata Afroamericano 1 su 84 Ebrei aschenaziti 1 su 29 Asiatico 1 su 242 Caucasico 1 su 28 Ispanico 1 su 59 Ebreo 1 su 32 Medio orientale 1 su 91 Nativo americano 1 su 70 Sudasiatico 1 su 118 Altra etnia 1 su 111 > 1 etnicità 1 su 34 Parte afroamericano 1 su 56 Parte caucasico 1 su 32 Parte ispanico 1 su 51 Non fornito 1 su 37 Tutti gli individui 1 su 38 Progettazione del saggio Tutte le regioni di codifica delle proteine nel gene CFTR inclusi 10 nt di sequenza intronica fiancheggiante sono rilevati per tutti gli esoni fatta eccezione di tre (esone 7, 10 e 20). Per l'esone 7 e l'esone 10, solo 5 nt di sequenza intronica fiancheggiante sono inclusi all'estremità 5' dell'esone per evitare Indel omopolimerici prossimali. Per l'esone 20, 30 nt di sequenza intronica fiancheggiante sono inclusi all'estremità 5' dell'esone in grado di rilevare la mutazione A>G. Inoltre il saggio rileva circa 100 nt di sequenza intronica fiancheggiante le regioni non tradotte (UTR) 5' e 3', 2 profonde mutazioni introniche ( kbA>G, kbC>T), 2 ampie delezioni (CFTRdele2,3, CFTRdele22,23) e la regione PolyTG/PolyT. La copertura completa del saggio è mostrata nelle posizioni delle coordinate genomiche elencate nella Tabella 2. Tabella 2 Copertura delle coordinate genomiche per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Avvio della coordinata genomica hg19 (cromosoma 7) Arresto della coordinata genomica hg19 (cromosoma 7) Lunghezza (coppia di basi) CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n3 Avvio della coordinata genomica hg19 (cromosoma 7) Arresto della coordinata genomica hg19 (cromosoma 7) Lunghezza (coppia di basi) CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon 7^ CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon 10^ CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Intron 12* CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon 20 # CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Intron 22* CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon CFTR_Exon Basi totali 5203** Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 3\n4 ^ Per l'esone 7 e l'esone 10, solo 5 nt di sequenza intronica fiancheggiante sono inclusi a valle per l'esone. Questo per evitare stretch omopolimerici in queste regioni. Nel caso dell'esone 10, questa è la regione PolyT/PolyTG nell'introne 9. Questa regione viene trattata in modo particolare e separatamente. * Per le mutazioni introniche profonde, sono inclusi anche 5 nucleotidi che fiancheggiano le varianti SNV su entrambi i lati. # Per l'esone 20, 30 nt di sequenza intronica fiancheggiate sono inclusi all'estremità 5' dell'esone per permettere il rilevamento della mutazione A>G. ** Con le due ampie delezioni e le regioni PolyTG/PolyT, il numero totale di posizioni/regioni è Principi della procedura Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina comporta due procedure principali. La prima consiste nel preparare manualmente i campioni per il sequenziamento, un'operazione detta preparazione della libreria. La preparazione della libreria consiste di quattro fasi principali: ibridazione, estensione-ligazione, amplificazione mediante PCR e normalizzazione della libreria. La seconda procedura consiste nel sequenziare il campione preparato mediante la chimica SBS (sequenziamento mediante sintesi) su MiSeqDx. Preparazione della libreria A B C Ibridazione: la prima fase consiste nell'ibridare un pool di oligonucleotidi a monte e a valle specifici per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing per il campione di DNA genomico. Al termine di questo processo, una procedura di lavaggio in tre fasi, con un filtro in grado di selezionare le dimensioni, rimuove gli oligonucleotidi non legati dal DNA genomico. Estensione-ligazione: la seconda fase collega gli oligonucleotidi a monte e a valle ibridati. Una DNA polimerasi si estende dagli oligonucleotidi a monte fino alla regione target e successivamente si lega all'estremità 5' dell'oligonucleotide a valle mediante una DNA ligasi. Il risultato consiste nella formazione di prodotti contenenti gli oligonucleotidi della fibrosi cistica specifici affiancati da sequenze necessarie per l'amplificazione. Amplificazione mediante PCR: la terza fase consiste nell'amplificazione dei prodotti dell'estensione-ligazione mediante primer che aggiungono sequenze di indici per il multiplex campioni, oltre a comuni adattatori necessari per la generazione dei cluster su MiSeqDx. Al termine di questo processo, una procedura di pulizia della PCR purifica i prodotti della PCR (indicati come libreria). 4 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n5 D Normalizzazione della libreria: la fase finale consiste nel normalizzare la quantità di ciascuna libreria onde garantire una rappresentazione più equilibrata nel pool finale di librerie. Al termine di questo processo, il pool di librerie viene caricato su MiSeqDx per il sequenziamento mediante la chimica SBS. Sequenziamento La chimica SBS utilizza un metodo che fa uso di terminatori reversibili per rilevare le singole basi nucleotidiche man mano che vengono incorporate in filamenti di DNA crescenti. Durante ciascun ciclo di sequenziamento, alla catena dell'acido nucleico viene aggiunto un solo deossinucleotide trifosfato (dntp) marcato in fluorescenza. Il nucleotide marcato funge da terminatore per la polimerizzazione, così dopo ogni incorporazione di dntp, il colorante fluorescente viene sottoposto a imaging al fine di identificare la base e quindi sottoposto a scissione enzimatica per consentire l'incorporazione del nucleotide successivo. Poiché tutti e quattro i dntp legati al terminatore reversibile (A, G, T, C) sono presenti come molecole singole e separate, la competizione naturale riduce al minimo le distorsioni dovute all'incorporazione. Le identificazioni delle basi vengono effettuate direttamente dalle misurazioni dell'intensità del segnale durante ogni ciclo di sequenziamento. Il risultato finale è un sequenziamento base per base. Analisi dei dati MiSeq Reporter elabora le identificazioni delle basi generate durante l'analisi primaria e produce informazioni su ciascun campione in base alle informazioni specificate nel foglio campioni, questa elaborazione si chiama analisi secondaria. L'analisi secondaria include de-multiplex, generazione di file FASTQ, allineamento, identificazione delle varianti e generazioni di file VCF che contengono le informazioni relative alle varianti del gene CFTR individuate in posizioni specifiche in un genoma di riferimento. De-multiplex: il de-multiplex costituisce la prima fase dell'analisi se nel foglio campioni sono elencati più campioni e la corsa presenta letture indici. Il de-multiplex separa i dati da un pool di campioni in base agli indici sequenza univoci che sono stati aggiunti durante la fase di amplificazione mediante PCR. Generazione di file FASTQ: dopo il de-multiplex, MiSeq Reporter genera file intermedi in formato FASTQ, un formato di testo utilizzato per rappresentare le sequenze. I file FASTQ contengono le letture di ciascun campione e i punteggi qualitativi, con l'esclusione delle letture dei cluster che non hanno attraversato il filtro. Allineamento: mediante l'allineamento è possibile confrontare le sequenze rispetto a un riferimento al fine di identificare una relazione fra le sequenze e assegnare un punteggio in base a regioni di similarità. Le letture allineate sono scritte nei file in formato BAM. MiSeq Reporter utilizza un algoritmo di Smith-Waterman con matrice a banda che esegue allineamenti locali di sequenze per determinare il grado di similarità fra due sequenze. delle varianti: durante questa fase vengono registrate le varianti di singolo nucleotide (SNV), le inserzioni e delezioni (Indel) e altre varianti strutturali in un file di testo libero (parsable) e standardizzato chiamato MiSeqDxCFClinicalSequencingAssay.txt. Per maggiori informazioni, vedere la sezione File report dell'analisi nella Guida per l'utente di MiSeq Reporter (n. codice _ITA). Limiti della procedura 1 Il saggio sequenzia le regioni seguenti nel gene CFTR: a Tutte le regioni di codifica delle proteine nel gene CFTR su 27 esoni b Tra 5 e 10 basi di sequenze introniche fiancheggianti c Cento nucleotidi di sequenza intronica alle regioni 5 e 3 non tradotte d Due mutazioni introniche profonde ( kbA>G, kbC>T) e La sequenza PolyTG/PolyT si trova nell'introne 9 f Un totale di posizioni/regioni delle possibili coppie di basi nel gene. 2 Per uso diagnostico in vitro. I risultati ottenuti usando il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina dovrebbero essere usati e interpretati nel contesto di una valutazione clinica completa. 3 Il saggio è progettato per sequenziare le regioni di codifica delle proteine e i confini introne/esone del gene CFTR e non comprende tutte le regioni introniche e le delezioni ampie. Pertanto, un risultato complessivo Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 5\n6 "wild type" non garantisce che nei campioni analizzati non siano presenti altre varianti/mutazioni del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR). Il saggio è progettato per rilevare due delezioni ampie specifiche: CFTRdele2,3 e CFTRdele22,23. Non saranno rilevate o segnalate altre delezioni ampie. Il saggio è convalidato solo per inserzioni e le delezioni fino a e includendo 3bp in dimensione. 4 La frequenza delle varianti identificate mediante questo saggio varia fra le diverse popolazioni. Con questo saggio non è possibile convalidare tutte le combinazioni delle varianti che possono essere rilevate nel gene CFTR. Si raccomanda all'utente di confermare varianti nuove e rare mediante un metodo di riferimento convalidato. 5 Come per qualsiasi saggio basato su ibridazione, polimorfismi o mutazioni latenti nelle regioni che legano gli oligonucleotidi possono interessare gli alleli sondati e, di conseguenza, le identificazioni effettuate. 6 Se per un campione vengono identificate più di due varianti, si raccomanda di verificare il risultato ripetendo il campione usando il Sistema dello strumento con gdna estratto fresco per escludere la contaminazione incrociata del campione. NOTA: quando vengono rilevate due o più varianti deve essere presa in considerazione la determinazione delle fasi (phasing) per l'aplotipo. Questo saggio non può determinare se le varianti sono in cis/trans rispetto alle altre varianti. 7 Nel software MiSeq Reporter, tutte le inserzioni/delezioni saranno lasciate allineate in regioni omopolimeriche. Ad esempio, la 444delA verrà identificata come una delezione GA-TC mentre la delezione viene riportata in dbsnp come una delezione G-ATC. Un'eccezione a questo sono le 135 variazioni della fibrosi cistica elencate nel database CFTR2 come causanti la malattia (basato sull'elenco delle varianti al settembre 2013); tutti gli Indel in regioni omopolimeriche entro questo gruppo di variazioni sono riportati come corrispondenti al report delle varianti previste in base al database CFTR Il saggio non può determinare se l'orientamento della PolyTG/PolyT si trova in cis/trans rispetto ad altre varianti. Per i pazienti con una R117H, dovrebbero essere eseguiti ulteriori test per determinare se una PolyTG/PolyT, che può incidere sul fenotipo clinico [ad. es., (TG) o 5T], è in orientamento cis/trans. PolyTG/PolyT sono regioni omopolimeriche note per essere difficili da sequenziare a causa dello scivolamento della polimerasi. 9 Questo saggio è progettato per essere eseguito esclusivamente in un formato 8 plex. Se non sono disponibili 6 campioni clinici, esclusi i controlli positivo e negativo, includere quindi altri campioni di DNA genomico umano per completare la corsa. Componenti del prodotto La piattaforma MiSeqDx Illumina è composta da: Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing (n. di catalogo DX ) Strumento MiSeqDx (N. di catalogo DX ) Reagenti Reagenti forniti I reagenti per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina (n. di catalogo DX ) sono forniti da Illumina. Questo kit è stato configurato per sei corse con un massimo di otto campioni per corsa (fino a 48 campioni totali). 6 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n7 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing, Scatola 1 Tabella 3 Scatola 1A Reagenti pre-amplificazione Componente Quantità Volume di riempimento Ingredienti attivi Conservazione Saggio CF Clinical 1 provetta 600 µl Soluzione acquosa tamponata contenente tra -25 C e -15 C Sequencing - pool di oligonucleotidi oligonucleotidi mirati al gene CFTR Tampone di 1 provetta 4,32 ml Soluzione acquosa tamponata contenente tra -25 C e -15 C ibridazione sali e formammide Miscela di estensioneligazione 1 provetta 4,8 ml Soluzione acquosa tamponata contenente tra -25 C e -15 C una miscela proprietaria di DNA polimerasi, DNA ligasi e dntp Primer indice C (A503), 1 provetta per 192 µl Primer per PCR con sequenze indice e tra -25 C e -15 C D (A504) e E (A505) primer adattatori di sequenziamento Primer indice 1 (A701), 1 provetta per 128 µl Primer per PCR con sequenze indice e tra -25 C e -15 C 2 (A702) e 10 (A710) primer adattatori di sequenziamento PCR polimerasi 1 provetta 56 µl DNA polimerasi proprietaria tra -25 C e -15 C Master Mix per PCR 1 provetta 2,8 ml Soluzione acquosa tamponata contenente sali e dntp tra -25 C e -15 C Tabella 4 Scatola 1B Reagenti post-amplificazione Componente Quantità Volume di riempimento Ingredienti attivi Conservazione Diluente 1 provetta 4,6 ml Soluzione acquosa tamponata contenente tra -25 C e -15 C normalizzazione libreria sali, 2-mercaptoetanolo e formammide Tampone di diluizione 1 provetta 4,5 ml Soluzione acquosa tamponata tra -25 C e -15 C libreria Controllo interno PhiX 1 provetta 10 µl Soluzione acquosa tamponata contenente DNA genomico PhiX tra -25 C e -15 C Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing, Scatola 2 Tabella 5 Scatola 2 Reagenti post-amplificazione Componente Quantità Indice Conservazione Cartuccia di reagenti MiSeqDx - saggio CF Clinical Sequencing 6 cartucce Cartuccia monouso che contiene i reagenti per la generazione dei cluster e il sequenziamento da utilizzarsi con MiSeqDx, compresi formammide, 2-mercaptoetanolo e DMSO < 2%. tra -25 C e -15 C Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing, Scatola 3 Tabella 6 Scatola 3A Reagenti pre-amplificazione Componente Quantità Volume di riempimento Ingredienti attivi Tampone di lavaggio 1 flacone 24 ml Soluzione acquosa tamponata contenente stringente sali, 2-mercaptoetanolo e formammide Tampone di lavaggio 1 provetta 4,8 ml Soluzione acquosa tamponata contenente universale sali Conservazione tra 2 C e 8 C tra 2 C e 8 C Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 7\n8 Tabella 7 Scatola 3B Reagenti post-amplificazione Componente Quantità Volume di riempimento Ingredienti attivi Microsfere per la 1 provetta 5 ml Soluzione acquosa tamponata contenente pulizia della PCR microsfere paramagnetiche in fase solida e polietilene glicole Lavaggio di 2 provette 4,8 ml Soluzione acquosa tamponata contenente normalizzazione della sali, 2-mercaptoetanolo e formammide libreria Microsfere libreria 1 provetta 1,2 ml Soluzione acquosa tamponata contenente microsfere paramagnetiche in fase solida Cella a flusso MiSeqDx 6 contenitori 1 cella a flusso Substrato di vetro con oligonucleotidi - saggio legati covalentemente CF Clinical Sequencing Conservazione tra 2 C e 8 C tra 2 C e 8 C tra 2 C e 8 C tra 2 C e 8 C Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing, Scatola 4 Tabella 8 Scatola 4 Reagenti post-amplificazione Componente Quantità Volume di riempimento Ingredienti attivi Conservazione Soluzione SBS MiSeqDx (PR2) - saggio CF Clinical Sequencing 6 flaconi 353,1 ml Soluzione acquosa tamponata tra 2 C e 8 C Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing, Scatola 5 Tabella 9 Scatola 5 Reagenti pre-amplificazione Componente Quantità Volume di riempimento Ingredienti attivi Conservazione Piastra filtro 6 piastre N.D. Piastra di microtitolazione in polipropilene con una membrana di polietersulfone modificata tra 15 C e 30 C Tabella 10 Scatola 5 Reagenti post-amplificazione Componente Quantità Volume di riempimento Ingredienti attivi Conservazione Tampone di eluizione 1 provetta 4,8 ml Soluzione acquosa tamponata tra 15 C e 30 C Tampone di conservazione della libreria 1 provetta 3,5 ml Soluzione acquosa tamponata tra 15 C e 30 C Reagenti richiesti, non forniti Reagenti pre-amplificazione 10 N NaOH (preparare da compresse o con una soluzione standard) Tampone TE Acqua priva di DNasi e di RNasi Reagenti post-amplificazione 10 N NaOH (preparare da compresse o con una soluzione standard) Etanolo, 200 proof (vol. 100%) per biologia molecolare Tampone TE 8 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n9 Acqua priva di DNasi e di RNasi Conservazione e manipolazione 1 Per temperatura ambiente si intende la temperatura compresa fra 15 C e 30 C. 2 I reagenti elencati di seguito sono spediti congelati e rimangono stabili se conservati a una temperatura fra -25 C e -15 C fino alla data di scadenza specificata. Saggio CF Clinical Sequencing - pool di oligonucleotidi Tampone di ibridazione Miscela di estensione-ligazione Primer indice C (A503), D (A504) e E (A505) Primer indice 1 (A701), 2 (A702) e 10 (A710) PCR polimerasi Master Mix per PCR Diluente normalizzazione libreria Tampone di diluizione libreria Controllo interno PhiX Cartuccia di reagenti MiSeqDx - saggio CF Clinical Sequencing A eccezione della cartuccia di reagenti, i reagenti rimangono stabili per un massimo di 6 cicli di congelamento/scongelamento effettuati prima della data di scadenza specificata. Non ricongelare la cartuccia di reagenti una volta scongelata. Può essere conservata per un massimo di 6 ore a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C. 3 I reagenti elencati di seguito sono spediti refrigerati e rimangono stabili se conservati a una temperatura tra 2 C e 8 C fino alla data di scadenza specifica. Tampone di lavaggio stringente Tampone di lavaggio universale Microsfere per la pulizia della PCR Microsfere libreria Lavaggio di normalizzazione della libreria Soluzione SBS MiSeqDx (PR2) - saggio CF Clinical Sequencing Cella a flusso MiSeqDx - saggio CF Clinical Sequencing 4 I reagenti elencati di seguito sono spediti a temperatura ambiente e rimangono stabili se conservati a tale temperatura fino alla data di scadenza specificata. Tampone di eluizione Piastra filtro Tampone di conservazione della libreria 5 Cambiamenti nell'aspetto fisico dei reagenti forniti possono indicare un deterioramento dei materiali. Non utilizzare i reagenti se si dovessero verificare tali cambiamenti (ad es. variazioni evidenti nel colore del reagente o opacità visibile con contaminazione microbica). 6 I reagenti del tampone di ibridazione, del tampone di lavaggio stringente e del diluente normalizzazione libreria potrebbero formare precipitati o cristalli visibili. Prima dell'uso, agitare energicamente, quindi ispezionare a occhio nudo per accertarsi che non vi sia presenza di precipitati. 7 Nella manipolazione di microsfere per la pulizia della PCR e microsfere libreria attenersi alle migliori pratiche riportate di seguito: Le microsfere non devono mai essere congelate. Riportarle a temperatura ambiente. Immediatamente prima dell'uso, agitarle bene finché sospensione e colore appaiono omogenei. Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 9\n10 Dopo aver aggiunto le microsfere miscelare bene il campione pipettando su e giù dieci volte. Per miscelare il campione è possibile utilizzare un agitatore. Incubare la miscela di microsfere/campione a temperatura ambiente per tutta la durata indicata. Seguire le istruzioni per l'uso del supporto magnetico. attendere che la soluzione diventi trasparente prima di aspirare. Tenere la piastra sul supporto magnetico durante l'aspirazione lenta del surnatante, facendo attenzione a non toccare le microsfere separate. 8 La piastra di amplificazione mediante PCR può restare sul termociclatore per tutta la notte, oppure può essere conservata a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per un massimo di due giorni. Prima di conservare la piastra a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C sigillarla bene. 9 Non congelare il reagente microsfere libreria o miscelarlo con il reagente diluente normalizzazione libreria se non vengono utilizzati immediatamente. 10 La piastra completa di normalizzazione della libreria può essere conservata a una temperatura compresa tra -25 C e -15 C per un massimo di 3 giorni. 11 La libreria di ampliconi raggruppati in pool può essere conservata tra a una temperatura compresa tra -25 C e -15 C per un massimo di 3 giorni. 12 Caricare immediatamente nella cartuccia del reagente un pool di ampliconi diluiti appena preparati. Se conservato, il pool di ampliconi diluiti può comportare una riduzione significativa della densità dei cluster. Apparecchiatura e materiali Apparecchiatura e materiali di consumo forniti, venduti separatamente 1 Strumento MiSeqDx, n. catalogo DX Kit TruSeq Index Plate Fixture, n. di catalogo FC Kit TruSeq Index Plate Fixture& Collar, n. di catalogo FC Tappi sostitutivi per adattatore indice, n. di catalogo DX Apparecchiatura e materiali richiesti, non forniti Apparecchiatura e materiali per pre-amplificazione 1 Blocco termico: è necessario un blocco termico per una piastra a 96 pozzetti. Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione. Sono accettabili i blocchi termici con coperchi riscaldati. Intervallo di temperatura: ambiente da +5 C a 99 C Regolazione della temperatura: ± 0,1 C a 37 C; ± 0,4 C a 60 C 2 Incubatore di campioni: è necessario un incubatore (forno per ibridazione). L'incubatore deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione. Intervallo di temperatura: da 10 C a 100 C Regolazione della temperatura: ± 0,2 C 3 Centrifuga da tavolo: è necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C. Come specificato sopra, nell'area di post-amplificazione è necessaria un'altra centrifuga. Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocità previste dal protocollo (da 280 a g) è accettabile. 4 Pipette di precisione: è necessaria una serie di pipette di precisione. Come specificato sopra, nell'area di postamplificazione è necessario un altro set. L'utilizzo di pipette di precisione è necessario per assicurare un'erogazione accurata di reagente e campione. È possibile utilizzare sia pipette monocanale che multicanale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5% del volume stabilito. 5 Materiali di consumo: sono necessari i seguenti materiali di consumo. Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti, 0,2 ml, polipropilene, o equivalente NOTA: assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico. Piastre di conservazione a 96 pozzetti, 0,8 ml (piastre MIDI) Bacinella per soluzione, in PVC, priva di DNAasi e RNAasi (vaschetta) 10 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n11 Sigillo adesivo in alluminio Sigillo per piastre PCR appropriato Punte di pipette dotate di barriera aerosol Apparecchiatura e materiali per post-amplificazione 1 Termociclatore: è necessario un termociclatore. Il termociclatore deve essere dotato di un coperchio riscaldato e soddisfare le seguenti specifiche di prestazione: Intervallo di controllo della temperatura: da 4 C a 99 C Accuratezza del controllo: ± 0,25 C da 35 C a 99 C 2 Agitatore per micropiastre: nell'area adibita al laboratorio post-amplificazione è necessario un agitatore di micropiastre. L'agitatore di piastre deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione: Velocità massima di miscelazione: rpm (giri/min) Intervallo di velocità di miscelazione: rpm (giri/min) 3 Centrifuga da tavolo: è necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C. Come specificato sopra, nell'area di pre-amplificazione è necessaria un'altra centrifuga. Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocità previste dal protocollo (da 280 a g) è accettabile. 4 Blocco termico: è necessario un blocco termico per le provette. Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione. Intervallo di temperatura: ambiente da +5 C a 99 C Regolazione della temperatura: ± 0,1 C a 37 C; ± 0,4 C a 60 C 5 Supporto magnetico: è necessario un supporto magnetico per una piastra a 96 pozzetti. Le prestazioni migliori si osservano quando i magneti si trovano sul lato del supporto e non nella parte inferiore. 6 Pipette di precisione: è necessaria una serie di pipette di precisione. Come specificato sopra, nell'area di pre-amplificazione è necessario un altro set. L'utilizzo di pipette di precisione è necessario per assicurare un'erogazione accurata di reagente e campione. È possibile utilizzare sia pipette mono-canale che multi-canale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5% del volume stabilito. 7 Materiali di consumo: sono necessari i seguenti materiali di consumo. Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti, 0,2 ml, polipropilene, o equivalente Piastre di conservazione a 96 pozzetti, 0,8 ml (piastre MIDI) NOTA: assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico. Provette coniche, 15 ml Provette per microcentrifuga Eppendorf (sono consigliate quelle con tappo a vite) Striscia a otto provette per PCR Bacinelle per soluzione, in PVC, priva di DNAasi e RNAasi (vaschetta) Sigilli adesivi in alluminio Sigilli adesivi per piastre Punte di pipette dotate di barriera aerosol Prelievo, trasporto e conservazione dei campioni NOTA Maneggiare tutti campioni come se fossero agenti potenzialmente infettivi. 1 Possono essere utilizzati campioni di sangue intero prelevati in provette K 2 EDTA. 2 I campioni di sangue intero possono essere conservati per non più di sette giorni a temperatura ambiente, fino a 30 giorni a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C o fino a 30 giorni se congelati tra -25 C e -15 C. 3 I campioni di sangue intero possono essere trasportati per non più di sette giorni a temperatura ambiente, fino a 30 giorni a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C, o fino a 30 giorni se congelati fra -25 C e -15 C. Il trasporto di sangue intero deve essere conforme alle regolamentazioni nazionali, federali, statali o locali per il trasporto di agenti eziologici. Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 11\n12 4 Non sono stati osservati eventi avversi sulle prestazioni dei saggio allorché il DNA genomico è stato sottoposto a sei cicli di congelamento/scongelamento. 5 Non sono stati osservati eventi avversi sulle prestazioni del saggio in presenza di campioni di sangue intero con elevati tassi di bilirubina, colesterolo, trigliceride, EDTA o emoglobina. Avvertenze e precauzioni ATTENZIONE La legge federale limita la vendita di questo dispositivo da parte o dietro prescrizione di un medico o di un medico autorizzato dalla legge dello stato in cui esercita, ad usare o ad ordinare l'uso del dispositivo. 1 Alcuni componenti di questo saggio contengono formammide, una ammide alifatica che è una probabile tossina riproduttiva. Per maggiori informazioni, vedere Reagenti a pagina 6. L'inalazione, l'ingestione, il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali. Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati conformemente alle norme di sicurezza in vigore localmente. Per informazioni, contattare l'assistenza tecnica Illumina. 2 Alcuni componenti di questo saggio contengono 2-mercaptoetanolo, un agente riducente. Per maggiori informazioni, vedere Reagenti a pagina 6. L'inalazione, l'ingestione, il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali. Utilizzarlo in un'area ben ventilata e smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati conformemente alle norme di sicurezza in vigore localmente. Per informazioni, contattare l'assistenza tecnica Illumina. 3 Maneggiare tutti campioni come se fossero agenti potenzialmente infettivi. 4 Il mancato rispetto delle procedure descritte può produrre risultati errati o una riduzione significativa della qualità del campione. 5 Adottare le normali precauzioni di laboratorio. Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere o fumare nelle aree designate per il lavoro. Manipolare i campioni e i reagenti del saggio indossando guanti e indumenti da laboratorio monouso. Dopo aver maneggiato i campioni e i reagenti del saggio lavarsi bene le mani. 6 Non utilizzare i componenti del saggio oltre la data di scadenza indicata sull'etichetta della confezione del saggio. Non scambiare i componenti di diversi lotti di saggi. I lotti di saggi sono identificati sull'etichetta della confezione del saggio. 7 Conservare i componenti del saggio alla temperatura indicata e in aree designate per la pre-amplificazione e la post-amplificazione. 8 Cicli ripetuti di congelamento-scongelamento (fino a 6) dei componenti dalla scatola 1 non compromettono l'integrità del saggio. 9 Onde evitare il degrado del campione o del reagente, accertarsi che tutti i vapori di sodio ipoclorito si siano dissipati completamente prima di iniziare il protocollo. 10 È necessario adottare idonee pratiche di laboratorio e una valida igiene per impedire la contaminazione di reagenti, strumenti e campioni di DNA genomico con i prodotti della PCR. La contaminazione da PCR può produrre risultati inesatti e inaffidabili. 11 Al fine di prevenire la contaminazione, accertarsi che le aree di pre-amplificazione e post-amplificazione siano dotate delle apposite attrezzature (ad es., pipette, punte di pipette, agitatori e centrifughe). 12 Evitare la contaminazione incrociata. Utilizzare punte di pipette nuove fra un campione e l'altro e fra le erogazioni di reagenti. Miscelare i campioni con una pipetta e centrifugare la piastra ove indicato. Non agitare le piastre. L'utilizzo di punte dotate di barriera aerosol riduce il rischio di contaminazione incrociata da carry-over di ampliconi o da campione a campione. 13 Le combinazioni indice-campione devono corrispondere esattamente a quelle del foglio campioni. La non corrispondenza fra il foglio campioni e il layout della piastra risulterà in una perdita di identificazione dei campioni positivi e nella refertazione di risultati errati. 14 Preparare sempre al momento l'etanolo all'80% per le fasi di lavaggio. L'etanolo può assorbire l'acqua dall'aria e influire sui risultati. 12 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n13 15 Assicurarsi che tutto l'etanolo venga rimosso dal fondo dei pozzetti durante le fasi di lavaggio. L'etanolo residuo può influire sui risultati. 16 Rispettare il tempo di asciugatura indicato dopo la fase del supporto magnetico al fine di garantire che l'evaporazione sia completa. L'etanolo residuo può influire sulle prestazioni delle reazioni successive. 17 Non mescolare il saggio CF Clinical Sequencing - pool di oligonucleotidi e il tampone di ibridazione per la conservazione. Usato in combinazione, il saggio CF Clinical Sequencing - pool di oligonucleotidi diventa instabile, anche se conservato congelato. 18 L'utilizzo di termociclatori a raffreddamento attivo (ad es., Peltier, raffreddato termoelettricamente) non è consigliato per la fase di ibridazione. La fase di raffreddamento passivo è cruciale per un'adeguata ibridazione. 19 Aggiungere sempre PCR polimerasi al Master Mix per PCR subito prima dell'uso. Non conservare mai la soluzione di lavoro combinata. 20 Durante la fase di normalizzazione della libreria, è estremamente importante risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria. Questo è fondamentale per ottenere una densità dei cluster omogenea sulla cella a flusso MiSeqDx. 21 Rispettare i tempi di incubazione specificati per la fase di normalizzazione della libreria. Un'incubazione inadeguata può influire sulla rappresentazione della libreria e sulla densità dei cluster. 22 A causa del numero di trasferimenti della piastra e della conseguente potenziale contaminazione, è importante fare molta attenzione per assicurare che il contenuto dei pozzetti rimanga totalmente al loro interno. Non far schizzare il contenuto. 23 L'input di DNA di 250 ng raccomandato permette la variazione della quantità del DNA; le prestazioni del saggio si basano su questo livello di input. Note sulle procedure 1 Illumina ritiene necessario che per ogni corsa, definita come una serie di campioni elaborati in parallelo, vengano inclusi un campione di DNA di controllo positivo e un controllo negativo (NTC o No Template Control, controllo senza templato). Il campione di DNA di controllo positivo deve essere un campione ben caratterizzato con una o più mutazioni note del gene CFTR. Illumina raccomanda di usare un controllo wild type. Il controllo wild type deve essere eseguito come un campione e non deve sostituire il controllo positivo o negativo. 2 Prima di iniziare il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing, estrarre e quantificare il DNA. 3 È possibile utilizzare qualsiasi metodo di estrazione del DNA approvato. 4 Quantificare il DNA con uno spettrofotometro. Verificare che il rapporto A260/A280 del campione di DNA sia > 1,5. Normalizzare il campione di DNA a 50 ng/µl. Per ciascun campione sono necessari 5 µl di DNA genomico (250 ng totali). Rendimento dei campioni e rappresentazione dell'indice Per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina, il rendimento dei campioni per corsa di MiSeqDx è di 8 campioni. I primer di indicizzazione usati durante l'amplificazione mediante PCR devono essere scelti in base al rendimento dei campioni finale desiderato per garantire diversità nella sequenza d'indice. MiSeqDx utilizza un LED verde per il sequenziamento delle basi G/T e un LED rosso per il sequenziamento delle basi A/C. Per garantire la corretta registrazione, a ogni corsa deve essere letto almeno uno dei due nucleotidi per ogni canale cromatico. È importante conservare l'equilibrio cromatico per ciascuna base di lettura indici sequenziata, altrimenti potrebbe verificarsi un problema di registrazione durante il sequenziamento della Lettura indici. Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 13\n14 Utilizzare il seguente set minimo di indici con bilanciamento dei colori per corse di sequenziamento di otto campioni: Tabella 11 Combinazioni primer indice per corse di sequenziamento a 8 campioni Primer indice 1 (A701) Primer indice 2 (A702) Primer indice 10 (A710) Primer indice C (A503) Campione 1 Campione 2 Campione 3 Primer indice D (A504) Campione 4 Campione 5 Campione 6 Primer indice E (A505) Campione 7 Campione 8 -- Se non sono disponibili sei campioni univoci (esclusi i controlli positivi e negativi), è accettabile completare la corsa con replicati di qualsiasi campione di DNA genomico umano. Istruzioni per l'uso Preparazione del foglio campioni per MiSeqDx 1 Nella schermata Welcome (Benvenuto) di Worklist Manager Illumina, selezionare Create Worklist (Crea lista di lavoro). 2 Nel campo Test Type (Tipo di test), selezionare CF Clinical Sequencing Assay (Saggio CF Clinical Sequencing). 3 Nel campo Worklist Name ( lista di lavoro), immettere il nome per il foglio campioni. Se per il nome del foglio campioni viene utilizzato l'id alfanumerico del codice a barre della cartuccia di reagenti, il software operativo MiSeq (MOS) troverà automaticamente il foglio campioni. Se per il foglio campioni viene utilizzato un qualsiasi altro nome, il pulsante Browse (Sfoglia) nel software operativo MiSeq (MOS) può essere utilizzato per trovare il foglio campioni corretto. 4 [Opzionale] Immettere una descrizione per identificare la corsa. 5 Assicurarsi che la data corrisponda alla data di inizio della corsa. 6 Selezionare Next (Avanti). Inserimento di informazioni sui campioni 1 Nella scheda Table (Tabella) o nella scheda Plate (Piastra), inserire le seguenti informazioni per ciascun pozzetto contenente campione: a Sample ID (ID campione): inserire un ID campione univoco. b Index 1 e Index 2 (Indice 1 e Indice 2): specificare l'adattatore dell'indice che verrà utilizzato per ogni Lettura indici. 2 [Opzionale] Per registrare informazioni più dettagliate sui campioni, inserire il nome e la descrizione di un campione. 3 [Opzionale] Per identificare i controlli sulla piastra, selezionare Negative (Negativo) o Positive (Positivo) dal menu a discesa Control (Controllo). 4 Andare alla scheda Plate Graphic (Schema piastra) e utilizzare l'opzione Copy to Clipboard (Copia in appunti) o Print (Stampa) per acquisire un'immagine della piastra campioni. 5 Selezionare Finish (Fine). Ibridazione del pool di oligonucleotidi Preparazione 1 Portare a temperatura ambiente il saggio CF Clinical Sequencing - pool di oligonucleotidi, il tampone di ibridazione, i campioni di DNA genomici e il campione di controllo positivo. 2 Inserire in un agitatore il saggio CF Clinical Sequencing - pool di oligonucleotidi e il tampone di ibridazione e agitare vigorosamente per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente disciolti, quindi centrifugare brevemente le provette per raccogliere il liquido. 3 Impostare un blocco termico per piastra a 96 pozzetti su 95 C. 14 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n15 4 Preriscaldare un incubatore a 37 C. 5 Creare la piastra campioni in base all'immagine stampata da IWM. Procedura 1 Impostare una nuova piastra PCR a 96 pozzetti (di seguito definita piastra HYB). 2 Aggiungere 5 µl di campione o controllo a 50 ng/µl (250 ng totali) ai pozzetti appropriati nella piastra HYB. Seguire il layout della piastra generato per la corretta selezione dei pozzetti. 3 Aggiungere 5 µl del saggio CF Clinical Sequencing - pool di oligonucleotidi a tutti i pozzetti contenenti il DNA genomico. 4 Aggiungere 40 µl di tampone di ibridazione a ogni campione nella piastra HYB. Pipettare delicatamente su e giù 3-5 volte per miscelare. 5 Sigillare la piastra HYB e centrifugare x g a 20 C per 1 minuto. 6 Inserire la piastra HYB nel blocco preriscaldato a 95 C e incubare per 1 minuto. 7 Ridurre la temperatura del blocco termico a 40 C e continuare a incubare fino a quando il blocco termico raggiunge 40 C (circa 80 minuti). Il raffreddamento graduale è essenziale per un'ibridazione corretta; pertanto, per questo processo non si consigliano termociclatori per PCR con raffreddamento attivo (ad es., Peltier, raffreddato termoelettricamente). PUNTO DI ARRESTO SICURO Quando il blocco termico raggiunge i 40 C, la piastra HYB è stabile a una temperatura di 40 C per 2 ore. Rimozione degli oligonucleotidi non legati Preparazione 1 Portare la miscela di estensione-ligazione, il tampone di lavaggio stringente e il tampone di lavaggio universale a temperatura ambiente e agitare brevemente. 2 Assemblare l'unità piastra filtro (d'ora in avanti denominata FPU) nell'ordine dall'alto verso il basso: coperchio, piastra filtro, colletto adattatore e piastra MIDI. 3 Pre-lavare la membrana della piastra filtro come segue: a Dispensare 45 µ di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto. b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a x g a 20 C per 5 minuti. Procedura 1 Estrarre la piastra HYB dal blocco termico e centrifugare a x g a 20 C per 1 minuto. 2 Trasferire tutto il volume di ciascun campione (circa 55 µl) nei corrispondenti pozzetti della piastra filtro. 3 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a x g a 20 C per 5 minuti. 4 Lavare la piastra filtro come segue: a Dispensare 45 µ di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione. b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a x g a 20 C per 5 minuti. 5 Ripetere il lavaggio come descritto nella fase precedente. NOTA Se il tampone di lavaggio non asciuga completamente, centrifugare di nuovo a x g a 20 C finché tutto il liquido non viene espulso (ulteriori 5-10 minuti). 6 Smaltire tutto il materiale defluito (contenente formammide), quindi riassemblare l'fpu. 7 Dispensare 45 µ di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione. 8 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a x g a 20 C per 10 minuti. NOTA Accertarsi che tutto il liquido sia defluito dopo la centrifugazione. Ripetere la centrifugazione se necessario. Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 15\n16 Estensione-ligazione degli oligonucleotidi legati Procedura 1 Aggiungere 45 µl di miscela di estensione-ligazione a ogni pozzetto di campione della piastra filtro. 2 Sigillare la piastra filtro con un foglio di allumino adesivo e quindi coprire con il coperchio. 3 Incubare l'unità FPU nell'incubatore preriscaldato a 37 C per 45 minuti. Amplificazione mediante PCR Preparazione 1 Preparare 0,05 N di NaOH fresco. 2 Determinare i primer indice da utilizzare in base alla stampa dello schema della piastra di Worklist Manager Illumina. 3 Portare Master Mix per PCR e i primer indice appropriati a temperatura ambiente. Agitare ogni provetta scongelata per miscelare e quindi centrifugare brevemente le provette. 4 Impostare una nuova piastra PCR a 96 pozzetti (di seguito definita piastra AMP). 5 Dispensare i primer indice sulla piastra AMP in base al foglio campioni come segue: a Dispensare 4 µl dei primer indice C (A503), D (A504) e E (A505) nei pozzetti appropriati in una colonna della piastra AMP. b Smaltire i tappi bianchi originali e applicare tappi bianchi nuovi. c Dispensare 4 µl dei primer indice selezionati 1 (A701), 2 (A702) e 10 (A710) nei pozzetti appropriati in una riga della piastra AMP. Le punte devono essere sostituite dopo ogni riga per evitare la contaminazione incrociata. d Smaltire i tappi arancioni originali e applicare tappi arancioni nuovi. 6 Preparare la soluzione di lavoro per la PCR con Master Mix per PCR/PCR polimerasi nel modo seguente: a Dispensare 5,6 µl di PCR polimerasi su 280 µl di Master Mix per PCR. b Capovolgere 20 volte la soluzione di lavoro per la PCR preparata per miscelarla. Procedura 1 Rimuovere la piastra FPU dall'incubatore e rimuovere il sigillo in alluminio. 2 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a x g a 20 C per 2 minuti. 3 Aggiungere 25 µl di 0,05 N di NaOH a ogni pozzetto di campione sulla piastra filtro. Pipettare NaOH su e giù 5-6 volte. 4 Coprire e incubare la piastra filtro a temperatura ambiente per 5 minuti. 5 Durante l'incubazione della piastra filtro, trasferire 22 µl della soluzione di lavoro per PCR in ogni pozzetto della piastra AMP contenente i primer indice. 6 Trasferire i campioni eluiti dal filtro alla piastra AMP come segue: a Pipettare i campioni nella prima colonna della piastra filtro su e giù 5-6 volte. b Trasferire 20 µl dalla piastra filtro alla colonna corrispondente della piastra AMP. c Pipettare delicatamente su e giù 5-6 volte per miscelare accuratamente il DNA con la soluzione di lavoro per PCR. d Trasferire le colonne restanti dalla piastra filtro alla piastra AMP in modo simile. Le punte devono essere sostituite dopo ogni colonna per evitare la contaminazione incrociata. 7 Sigillare la piastra AMP e assicurarla con un rullo di gomma. 8 Centrifugare a x g a 20 C per 1 minuto. 9 Trasferire la piastra AMP nell'area di post-amplificazione. 10 Eseguire la PCR utilizzando il seguente programma su un termociclatore: 95 C per 3 minuti 25 cicli di: 16 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n17 95 C per 30 secondi 62 C per 30 secondi 72 C per 60 secondi 72 C per 5 minuti Mantenere a 10 C PUNTO DI ARRESTO SICURO Se non si procede immediatamente alla pulizia della PCR, la piastra AMP può restare sul termociclatore per la notte oppure può essere conservata a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per massimo 48 ore. Pulizia della PCR Preparazione 1 Portare le microsfere per la pulizia della PCR a temperatura ambiente. 2 Preparare al momento etanolo all'80% a partire dall'etanolo assoluto. Procedura 1 Centrifugare la piastra AMP a x g a 20 C per 1 minuto. 2 Impostare una nuova piastra MIDI (di seguito definita piastra CLP). 3 Capovolgere 10 volte le microsfere per la pulizia della PCR. Agitare energicamente e quindi capovolgere altre 10 volte. Controllare visivamente la soluzione per assicurarsi che le microsfere siano risospese. 4 Aggiungere 45 µl di microsfere per la pulizia della PCR a ogni pozzetto di campione della piastra CLP. 5 Trasferire l'intero prodotto per PCR dalla piastra AMP alla piastra CLP. 6 Sigillare la piastra CLP e agitare su un agitatore per micropiastre a rpm per 2 minuti. 7 Incubare a temperatura ambiente senza agitare per 10 minuti. 8 Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o fino alla scomparsa del surnatante. 9 Con la piastra CLP sul supporto magnetico, rimuovere attentamente e smaltire il surnatante. 10 Con la piastra CLP sul supporto magnetico, lavare le microsfere come segue: a Dispensare 200 µl di etanolo all'80% appena preparato in ogni pozzetto contenente il campione. b Incubare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 30 minuti o finché il surnatante è limpido. c Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante. 11 Ripetere il lavaggio come descritto nella fase precedente. 12 Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 µl per rimuovere l'eccesso di etanolo. 13 Rimuovere la piastra CLP dal supporto magnetico e asciugare all'aria le microsfere per 10 minuti. 14 Dispensare 30 µ di tampone di eluizione in ciascun campione e agitare brevemente. 15 Sigillare la piastra CLP e agitare su un agitatore per micropiastre a rpm per 2 minuti. Dopo aver agitato, controllare che i campioni siano risospesi. Altrimenti, ripetere questo passaggio. 16 Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti. 17 Posizionare la piastra CLP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finché il surnatante è limpido. 18 Impostare una nuova piastra MIDI (di seguito definita piastra LNP). 19 Trasferire 20 µl di surnatante dalla piastra CLP alla piastra LNP. 20 [Opzionale] Trasferire i restanti 10 µl di surnatante dalla piastra CLP a una nuova piastra ed etichettare la piastra con il nome della corsa e la data. Conservare questa piastra a una temperatura compresa tra -25 C e -15 C fino al completamento della corsa di sequenziamento e analisi dei dati. I prodotti per PCR puliti possono essere usati per scopi di ricerca ed eliminazione guasti in caso di problemi a carico dei campioni. PUNTO DI ARRESTO SICURO Se ci si ferma a questo punto, sigillare la piastra LNP e centrifugare a x g a 20 C per 1 minuto. La piastra è stabile per un massimo di 3 ore a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C. Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 17\n18 Normalizzazione della libreria Preparazione 1 Preparare 0,1N di NaOH fresco. 2 Portare il diluente normalizzazione libreria, le microsfere libreria e il lavaggio di normalizzazione della libreria a temperatura ambiente. 3 Agitare il diluente normalizzazione libreria energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti. 4 Agitare le microsfere libreria energicamente per 1 minuto con inversione intermittente fino a risospensione delle microsfere e assenza di pellet sul fondo della provetta quando quest'ultima viene capovolta. Procedura 1 Miscelare il diluente normalizzazione libreria e le microsfere libreria in una provetta nuova da 1,5 ml come segue: a Dispensare 394 µl di diluente normalizzazione libreria. b Pipettare le microsfere libreria su e giù 10 volte per risospenderle. NOTA È fondamentale risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria in fondo alla provetta. L'uso di una provetta P1000 garantisce che le microsfere vengano risospese in modo omogeneo e che non ci sia massa di microsfere sul fondo della provetta. Questo è fondamentale per ottenere una densità dei cluster omogenea sulla cella a flusso. c Pipettare 72 µl di microsfere libreria nella provetta contenente diluente normalizzazione libreria. d Miscelare capovolgendo la provetta volte. 2 Dispensare 45 µl della soluzione di lavoro di diluente normalizzazione libreria/microsfere libreria combinata in ogni pozzetto della piastra LNP contenente le librerie. 3 Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a rpm per 30 minuti. 4 Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o fino alla scomparsa del surnatante. 5 Con la piastra LNP sul supporto magnetico, rimuovere attentamente e smaltire il surnatante. 6 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e lavare le microsfere con il lavaggio di normalizzazione della libreria come segue: a Dispensare 45 µ di lavaggio di normalizzazione della libreria in ciascun pozzetto contenente il campione. b Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a rpm per 5 minuti. c Posizionare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finché il surnatante è limpido. d Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante. 7 Ripetere la procedura del lavaggio di normalizzazione della libreria come descritto nella fase precedente. 8 Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 µl per rimuovere l'eccesso di lavaggio di normalizzazione della libreria. 9 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e dispensare 30 µl di 0,1 N di NaOH in ogni pozzetto. 10 Sigillare la piastra LNP e agitare su un agitatore per micropiastre a rpm per 5 minuti. 11 Durante l'eluizione di 5 minuti, impostare una nuova piastra PCR con 96 pozzetti (di seguito definita piastra SGP). 12 Dispensare 30 µl di tampone di conservazione della libreria a ciascun pozzetto da usare nella piastra SGP. 13 Dopo l'eluizione di 5 minuti, assicurarsi che tutti i campioni nella piastra LNP siano completamente risospesi. Se i campioni non sono completamente risospesi, pipettare delicatamente i campioni su e giù oppure battere delicatamente la piastra sul banco per risospendere le microsfere, quindi agitare per altri 5 minuti. 18 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\n19 14 Posizionare la piastra LNP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti. 15 Trasferire il surnatante dalla piastra LNP alla piastra SGP. Pipettare delicatamente su e giù 5 volte per miscelare. 16 Sigillare la piastra SGP e centrifugare a x g a 20 C per 1 minuto. PUNTO DI ARRESTO SICURO Qualora non si proceda immediatamente alla creazione di un pool di librerie e al successivo sequenziamento su MiSeqDx, conservare la piastra SGP sigillata tra -25 C e -15 C per un massimo di 3 giorni. Creazione di pool di librerie Preparazione del pool di librerie 1 Predisporre un blocco termico adatto a centrifugare provette da 1,5 ml a 96 C. 2 In un portaghiaccio, preparare un bagno di acqua e ghiaccio. Raffreddare il tampone di diluizione libreria nel bagno di acqua e ghiaccio. 3 Cominciare a scongelare la cartuccia di reagenti MiSeqDx. Preparazione di una soluzione di diluizione fresca di NaOH ATTENZIONE L'utilizzo di una soluzione di diluizione fresca di NaOH è essenziale per denaturare completamente i campioni in vista della generazione dei cluster sul dispositivo MiSeqDx. 1 Combinare i seguenti volumi in una provetta per microcentrifuga: Acqua priva di DNAsi e di RNAsi (900 µl) 1,0 N di NaOH (100 µl) 2 Capovolgere la provetta diverse volte per miscelare. Denaturazione e diluizione del controllo interno PhiX 1 Combinare i seguenti volumi per diluire la libreria del controllo interno PhiX a 2 nm: Libreria del controllo interno PhiX da 10 nm (2 µl) 1X tampone TE (8 µl) 2 Combinare i seguenti volumi per ottenere una libreria del controllo interno PhiX da 1 nm: Libreria del controllo interno PhiX da 2 nm (10 µl) 0,1 N NaOH (10 µl) 3 Inserire brevemente in un agitatore per miscelare la soluzione della libreria del controllo interno PhiX da 1 nm. 4 Centrifugare la soluzione di templato a 280 x g a 20 C per 1 minuto. 5 Incubare per 4,5 minuti a temperatura ambiente per denaturare la libreria del controllo interno PhiX in filamenti singoli. 6 Aggiungere il seguente volume di tampone di diluizione libreria pre-raffreddato nella provetta contenente la libreria del controllo interno PhiX denaturata per ottenere una libreria del controllo interno PhiX da 20 pm. Libreria del controllo interno PhiX denaturata (20 µl) Tampone di diluizione libreria pre-raffreddato (980 µl) Preparazione della cartuccia di reagenti 1 Scongelare la cartuccia di reagenti MiSeqDx - saggio CF Clinical Sequencing in un bagnomaria contenente abbastanza acqua deionizzata a temperatura ambiente così da immergere la base della cartuccia di reagenti fino alla linea di livello acqua stampata sulla cartuccia stessa. Evitare che l'acqua superi la linea di massimo livello acqua. 2 Lasciare la cartuccia di reagenti a scongelare a bagnomaria a temperatura ambiente per circa un'ora o fino a completo scongelamento. Aprile 2014 N. codice Rev. A ITA 19\n20 3 Rimuovere la cartuccia dal bagnomaria e batterla delicatamente sul banco per far fuoriuscire l'acqua in eccesso dalla base. Asciugare la base della cartuccia. Verificare che sulla parte superiore della cartuccia di reagenti non sia caduta dell'acqua. Ispezione della cartuccia di reagenti 1 Capovolgere la cartuccia dieci volte per miscelare i reagenti scongelati e poi ispezionare visivamente tutti i serbatoi per accertarsi che siano scongelati. NOTA È fondamentale che i reagenti nella cartuccia siano scongelati completamente e miscelati per assicurare il sequenziamento corretto. 2 Ispezionare visivamente il reagente nella posizione 1 per accertarsi che sia ben miscelato e privo di precipitati. 3 Battere delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d'aria nei reagenti. NOTA I tubi dei pescanti del MiSeqDx vanno fino al fondo di ciascun serbatoio per aspirare i reagenti, per questa ragione è importante che i serbatoi non contengano bolle. 4 Riporre la cartuccia in ghiaccio o conservarla a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C (fino a 6 ore) finché non si è pronti a impostare la corsa. Per risultati ottimali, procedere direttamente caricando il campione e impostando la corsa. Preparazione dei campioni per il sequenziamento 1 Portare il tampone di diluizione libreria a temperatura ambiente. Agitare il tampone di diluizione libreria energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti. 2 Se la piastra SGP è stata conservata congelata, scongelarla la piastra SGP fino a raggiungere la temperatura ambiente. 3 Centrifugare la piastra SGP a x g a 20 C per 1 minuto. 4 Predisporre una provetta Eppendorf nuova (d'ora in avanti indicata come provetta PAL). 5 Se la piastra SGP è stata conservata congelata, mescolare ciascuna libreria da sequenziare pipettando su e giù per 3-5 volte. 6 Trasferire 5 µl di ciascuna libreria da sequenziare dalla piastra SGP a una striscia a otto provette per PCR. Sigillare l'sgp con un sigillo adesivo per piastre e metterla da parte. NOTA Dopo l'uso, conservare la piastra SGP fra -25 C e -15 C. La piastra SGP sigillata rimane stabile per un massimo di 3 giorni. 7 Combinare e trasferire il contenuto della striscia a otto provette per PCR nella provetta PAL. Miscelare energicamente la provetta PAL in un agitatore. 8 Predisporre una provetta Eppendorf nuova (d'ora in avanti indicata come provetta DAL). 9 Dispensare 585 µl di tampone di diluizione libreria nella provetta DAL. 10 Dispensare 6 µl di controllo interno PhiX 20 pm nella provetta DAL. Pipettare su e giù per 3-5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo. 11 Trasferire 9 µl di PAL nella provetta DAL contenente il tampone di diluizione libreria. Pipettare su e giù per 3-5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo. 12 Mescolare la DAL agitando la provetta molto velocemente. 13 Centrifugare la provetta DAL a x g a 20 C per 1 minuto. 14 Incubare la provetta DAL in un blocco termico a 96 C per 2 minuti. 15 Dopo l'incubazione, capovolgere la provetta DAL 1-2 volte per mescolarla, quindi porla immediatamente in un bagno di acqua e ghiaccio. 16 Tenere la provetta DAL nel bagno di acqua e ghiaccio per 5 minuti. 20 N. codice Rev. A ITA Aprile 2014\nPER USO DIAGNOSTICO IN VITRO N. di catalogo DX-102-1001: 6 corse, fino a 48 campioni per kit Uso previsto Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina è un sistema diagnostico in vitro\nSaggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione\nSaggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO Introduzione 3 Informazioni preliminari 7 Flusso di lavoro del saggio 20 Preparazione del foglio campioni\nKit MiSeqDx Universal 1.0 Guida di riferimento\nKit MiSeqDx Universal 1.0 Guida di riferimento PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO Introduzione 3 Informazioni preliminari 7 Flusso di lavoro del protocollo 19 Preparazione del foglio campioni per MiSeqDx 20\nSaggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO N. di catalogo DX-102-1001: 6 corse, fino a 48 campioni per kit Uso previsto Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing\nPER USO DIAGNOSTICO IN VITRO Data: Descrizione: N. di lotto del kit Illumina: DI PROPRIETÀ DI ILLUMINA Febbraio 2015 Pagina 1 di 19 Materiali di consumo Elemento Pool di oligonucleotidi personalizzati\nSaggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO Introduzione 4 Informazioni preliminari 7 Flusso di lavoro del saggio 16 Preparazione del foglio campioni\nGuida di consultazione per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing\nGuida di consultazione per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO Introduzione 4 Informazioni preliminari 7 Flusso di lavoro del saggio 16 Preparazione del foglio


Cuoco a domicilio Lomagna\nCuoco e tutor gastronomico a domicilio. La nostra passione per la buona tavola a casa tua! Siamo cuochi per passione e professionalità, ancora prima che chef. Ci piace la buona tavola, le cose semplici e amiamo riscoprire i sapori tradizionali nei pasti di tutti i giorni. Si noi al cibo non ci giriamo tanto attorno, lo cuciniamo con cura e proviamo anche a presentarlo in modo gradevole senza esagerare però! Se desideri una cucina molto sofisticata come propongono chef famosi, hai una soluzione: chiama loro! Noi siamo bravi perché scegliamo con cura le materie prime da proporti e ti offriamo un aiuto con un servizio semplice, quotidiano e gustoso. Il nostro capo cuoco, Marco F. possiede la qualifica di cuoco conferita dall'APCI - Associazione Professionale Cuochi Italiani. Hai cercato un cuoco a domicilio Lomagna.


Studioata | Studioata lavora e ricerca nel campo delle costruzioni, degli interni, del design di prodotto, della grafica e della comunicazione.\nStudioata fake flower power\n... il menù è in alto a destra ...\n18 Gennaio 2019 News\nItalian Pavilion – Berlino 69\nItalian Pavilion – 69° Berlin International Film Festival Italian Pavilion in versione punk. L’allestimento, commissionato da Luce Cinecittà, vede l’utilizzo di uno stile grafico forte e caratterizzante, liberamente ispirato ai lavori dell’artista inglese Jamie Reid, che nel corso della sua carriera ha realizzato alcune copertine per i Sex Pistols. Pareti con fondi scuri ed..\n12 Dicembre 2018 News\nVieni a scoprire i progetti di Studioata. Nuovo appuntamento della rassegna ArchiHour 2018, ciclo di incontri promossi da IAAD e R.B.C., nel quale Studioata si racconterà attraverso i propri progetti e le proprie esperienze. “Una finestra sulle Langhe” il titolo dell’incontro.\nStudioata festeggia il Natale. Mercoledì 12 Dicembre dalle 18,30 si terrà la Festa di Natale di Studioata, passa a trovarci e vieni a prendere il nuovo frutto dell’albero dello studio…le fragole!\nJesi Città Regia\nBerlino Film Festival 2019\nUna finestra sulle langhe\nAEG Coop – Bilanci 2017\nAREE ED ATTIVITÀ\n"Rappresentazione e dialogo fra elementi tangibili e sovrastrutture\nimmateriali e mutevoli...(?)"\n"Rappresentazione e dialogo\nfra elementi tangibili e sovrastrutture\n"La comunicazione in un progetto è fondamentale: eseguiamo lavori\ndi editoria, di branding e di web design."\n"La comunicazione in un progetto\nè fondamentale: eseguiamo lavori\n"Siamo curiosi, sperimentiamo, studiamo prototipi e progettiamo\noggetti per la produzione industriale."\n"Siamo curiosi, sperimentiamo,\nstudiamo prototipi e progettiamo\n"Curiamo iniziative culturali, allestimenti e organizzazione di\nmostre e conferenze."\n"Curiamo iniziative culturali,\nallestimenti e organizzazione di\n© Studioata 2016\nVia Belfiore, 36\nTel +39 011 6502346\nfax +39 011 19714269


BTC € 27,821 ETH € 1,876 BNB € 281 SOL € 49 XRP € 0.39 DOGE € 0.08\nStando a quanto riportato sabato 3 marzo dal portale d'informazione locale Nikkei Asian Review, due associazioni commerciali giapponesi operanti nel campo delle criptovalute hanno concordato di formare una nuova organizzazione, il quale nome non è stato ancora rivelato, che mira ad autoregolamentare il mercato delle monete digitali in collaborazione con la Financial Services Agency (FSA).\nQuesta collaborazione arriva in seguito all'attacco informatico di gennaio ai danni dell'exchange Coincheck, che ha portato al furto di oltre 534 milioni di dollari in NEM: il più grande hack nel mondo delle criptovalute sin dai tempi di Mt. Gox. L'attacco, reso possibile grazie ad un hot wallet poco sicuro nel quale Coincheck conservava i fondi NEM, ha portato la FSA a condurre una serie d'ispezioni di sicurezza nelle sedi dei 15 exchange non ancora certificati dal governo, compreso Coincheck.\nLe associazioni commerciali che desiderano l'autoregolamentazione, una delle quali è la Japan Cryptocurrency Business Association (JCBA), rappresentano al momento i 16 exchange approvati nel mercato delle criptovalute. Tali operatori lavoreranno a stretto contatto per redigere delle norme di sicurezza per gli investitori, compresa una serie di linee guida per le Initial Coin Offerings (ICO). Nikkei Asian Review afferma che l'organizzazione si assicurerà che tutti i membri rispettino le leggi, in modo del tutto simile all'operato della Japan Securities Dealers Association.\nTaizen Okuyama, presidente della piattaforma per il cambio di valuta estera Money Partners Group nonché direttore della JCBA, sarà il presidente della nuova organizzazione. Okuyama ha dichiarato ai microfoni di Nikkei Asian Review che l'obiettivo di questo progetto è di "rendere possibile l'autoregolamentazione del settore delle criptovalute".\nYuzo Kano, CEO della piattaforma d'exchange bitFlyer e direttore della Japan Blockchain Association (JBA), sarà invece il vicepresidente dell'associazione.\nIn quanto organismo indipendente di regolamentazione approvato dal governo, la nuova organizzazione potrà ad esempio proibire l'utilizzo di certe criptovalute agli operatori del paese nel caso in cui si sospettasse che tali monete vengano utilizzate per il riciclaggio di denaro. In attesa dell'approvazione della FSA, il nuovo ente di regolamentazione verrà temporaneamente reso disponibile per gli exchange e gli operatori già certificati.\nA febbraio di quest'anno, sette importanti compagnie operanti nel campo delle criptovalute hanno unito le forze per formare CryptoUK, la prima organizzazione per l'autoregolamentazione del mercato delle monete digitali nel Regno Unito.


Nuance Dragon Drive vuole farvi parlare con la vostra auto, senza frasi da robot | SmartWorld\nCosimo Alfredo Pina del 08 giugno 2017, 17:06\nDopo il mondo enterprise con Nina, Nuance adesso punta all'automotive con Dragon Drive, una piattaforma basata su intelligenza artificiale pensata per permettere all'utente di conversare in maniera naturale con la propria auto.\nNulla che per ora sia alla portata diretta dell'automobilista, ma una soluzione indirizzata alle case automobilistiche. Le macchine integrate con Dragon Drive, spiega Nuance, saranno in grado di rispondere a comandi vocali per navigazione, musica, informazioni anche quando impartiti in maniera più umana e non necessariamente con frasi sintetiche e prefissate.\nSulla carta molto interessante perché Nuance parla anche di interazioni car-to-home e home-to-car, quindi potremo comandare i dispositivi smart di casa dall'auto e viceversa. Pensate al poter impostare la destinazione del navigatore dell'auto mentre si sta uscendo di casa, oppure accendere il climatizzatore mentre stiamo rientrando.\nQualcosa di simile è già possibile con Amazon Alexa, ma solo negli Stati Uniti e con certi accessori o modelli di auto. Speriamo che sia proprio Nuance con il suo Dragon Drive a sdoganare il tutto anche qui da noi.\nL'assistente automotive di Dragon Drive personalizza l'esperienza in auto offrendo accesso illimitato a applicazioni e servizi per conducenti e passeggeri, oltre a estendere la connettività all’interno della smart home\nDragon Drive, il futuro dell'auto iperconnessa?


Argomento del corso:L'eccezione "oggettiva": quando la lirica d'oc sfiora la realtà (40 ore, 6 cfu)\nUnità didattica A (20 ore, 3 cfu): Tematiche soggettive e tematiche oggettive nella lirica d'oc: una breve introduzione. Analisi e commento di alcuni esempi di generi a implicazione femminile\nUnità didattica B (20 ore, 3 cfu): Analisi e commento di alcuni testi a contenuto satirico-politico\nIl corso è principalmente rivolto agli studenti della laurea magistrale in Lettere moderne e conferisce 6 cfu.\nIl corso analizzerà alcuni testi che si pongono al crocevia tra un'espressione poetica di tipo soggettivo e aulico (quella che possiamo genericamente etichettare come grand chant courtois) e una d'ispirazione più immediata, che può coinvolgere tematiche di carattere popolare e/o modalità di ascendenza non-lirica.\nConoscenze. Conoscenza approfondita della storia della letteratura provenzale medievale, dalle Origini alla prima metà del XIV secolo. Padronanza della grammatica storica dell'occitano, con attenzione per aspetti caratteristici delle più importanti varietà interne al sistema e per le forme dell'interferenza linguistica che trova spazio in alcune delle aree di maggiore diffusione della letteratura provenzale nel Medioevo (Italia e Catalogna in particolare). Conoscenza delle caratteristiche generali della tradizione manoscritta; in particolare, per quanto riguarda i testimoni della lirica, conoscenza dell'organizzazione interna dei singoli canzonieri e dei rapporti stemmatici reciproci.\nCapacità. 1) Capacità di tradurre, comprendere e analizzare approfonditamente i testi presentati durante il corso, individuando e discutendo in maniera problematica le loro peculiarità al fine di collocarli nel panorama storico-letterario, chiarirne la natura linguistica, precisarne la posizione nella storia della tradizione. 2) Identificazione e discussione dei problemi interpretativi, con consapevolezza delle diverse prospettive metodologiche. 3) Utilizzo opportuno e autonomo della bibliografia di supporto. 4) Nell'esposizione orale, capacità di esprimersi con chiarezza e rigore, impiegando il linguaggio specifico della disciplina.\nA. Roncaglia, La lingua dei trovatori, Roma, Edizioni dell'Ateneo.\nIn tempo utile per l'inizio del corso verrà predisposta una dispensa che conterrà i testi che verranno analizzati durante le lezioni e alcuni saggi critici.\nLa frequenza al corso è fondamentale per la qualità della preparazione all'esame e dunque caldamente raccomandata. Gli eventuali studenti non frequentanti dovranno concordare per tempo, e individualmente, il programma d'esame col docente.\nLa prova orale consiste di un colloquio sugli argomenti a programma, volto ad accertare le competenze dello studente in ambito storico-letterario, filologico e linguistico.


Cena tra amici (2012) - Trama, Cast, Recensioni, Citazioni e...\n/ 20127.2201 voti\nIl nome scelto per un bambino da poco concepito diventa il principale tema di discussione di una cena tra amici: l'apparentemente innocente argomento scatena una serie di reazioni inaspettate.\nVota e Commenta Cena tra amici: ISCRIVITI\nAttori principali: Patrick Bruel Valérie Benguigui Charles Berling Guillaume de Tonquédec Judith El ZeinFrançoise Fabian, Yaniss Lespert, Miren Pradier, Alexis Leprise, Juliette Levant, Bernard Murat\nSceneggiatura/Autore: Alexandre de La Patellière, Alexandre de La Patellière, Matthieu Delaporte, Matthieu Delaporte\nProduttore: Jérôme Seydoux, Dimitri Rassam\nDove vedere in streaming Cena tra amici\nSimpaticissimo! 7,5 / 7 Gennaio 2017 in Cena tra amici\nUna tranquilla e abitudinaria cena tra amici si trasforma in una guerra di parole e cose non dette, tutto nato dal nome scelto per il futuro figlio di una delle coppie.\nLe commedie francesi sanno sempre fare centro! Non vi racconto altro, ma vedetelo perché vi trascina con curiosità verso il curioso finale.\n7,5, attori davvero bravi.\nGeniale / 4 Febbraio 2016 in Cena tra amici\nQuando si hanno ottime idee e sceneggiature non servono effetti speciali o altre diavolerie tecnologiche per confezionare un buon film. Cinque familiari che si ritrovano per una semplice cena e accade di tutto partendo da uno stupido scherzo.\nESILARANTE!!! / 14 Dicembre 2015 in Cena tra amici\nMa che carino questo film.\nUna semplice cena tra amici e parenti scatena un vero putiferio.\nUsciranno verità nascoste insospettate.\nPare ci sia una versione italiana… Preferisco l’originale, sempre…\nDa vedere in compagnia… Magari escono fuori altre novità…\n12 Maggio 2013 in Cena tra amici\n2 Maggio 2013 in Cena tra amici\nQuando credi che il film sia finito…ti lanciano un’altra bomba xD Mi ha fatto morire xD


Falsi incidenti per truffare le assicurazioni, sette indagati. A capo due fratelli avvocati | Soverato Web\nFalsi incidenti per truffare le assicurazioni, sette indagati. A capo due fratelli avvocati\nOperazione “VIII comandamento”. Coordinati dalla procura di Reggio Calabria, diretta dal Procuratore Giovanni Bombardieri, i carabinieri del Nucleo Investigativo del Comando provinciale e delle Compagnie di Reggio Calabria e Melito Porto Salvo, hanno dato esecuzione a un decreto di perquisizione domiciliare nei confronti di 7 indagati per associazione per delinquere finalizzata alla commissione di truffe assicurative, falsa testimonianza e corruzione.\nA capo dell’organizzazione due fratelli avvocati. Gli indagati sono tutti reggini. Nel corso delle operazioni si è inoltre proceduto dare esecuzione al decreto di sequestro preventivo a carico un’autocarrozzeria del rione Modena di Reggio Calabria e di un centro protesi dentale a Reggio Calabria – Gallico.\nL’indagine, coordinata dal Sostituto Procuratore Dott. Stefano Musolino, è stata avviata per riscontrare parte delle dichiarazioni di un collaboratore di giustizia. Indicati, in particolare, due fratelli, entrambi avvocati del Foro di Reggio Calabria, che si occupavano di pratiche riguardanti incidenti stradali.\nSarebbero stati loro a capo dell’organizzazione specializzata in truffe ai danni delle compagnie assicurative simulando incidenti per ottenere risarcimenti dalle compagnie assicurative. Riscontrate richieste risarcitorie per oltre 100 mila euro.\nPubblicato da: Redazione // Cronaca // Reggio Calabria // Dicembre 3, 2019\n← Due giovani calabresi beccati sull’A1 con 300mila euro in contanti nascosti in un doppio fondo Poste Italiane assume portalettere anche in Calabria →


I Furoshiki originali! - Blog Casa Cenina\nQuando abbiamo deciso di scommettere sui manici Miyako:\nC’è un mondo dietro questi deliziosi tessuti:\nScoprili qui e… buon divertimento!\nNel film “L’ultimo Samurai”, il tormentato veterano della Guerra Civile Americana interpretato da Tom Cruise scrive questo dei giapponesi: “Sono un popolo enigmatico. Dal momento in cui si svegliano si dedicano a raggiungere la perfezione in ogni gesto”.\nQuella perfezione, in effetti, è così evidente ancora oggi: basti pensare al fascino silenzioso e delicato di origami e ikebana; ma anche all’eleganza del ricamo sashiko e delle fantasie quilting del Paese del Sol Levante e, adesso, anche del Furoshiki.\nabbiamo scoperto i Furoshiki: l’involucro di tessuto utilizzato in Giappone già nel 1600 per “confezionare” e trasportare qualunque oggetto di uso quotidiano.\nTuttavia, è proprio nei nostri anni che i Furoshiki si sono imposti come alternativa eco-sostenibile ai sacchetti (in primis quelli di plastica!), offrendo una versatilità eccezionale e richiamando l’attenzione anche di artisti molto noti in Giappone, che hanno iniziato a firmarne le fantasie.\ne noi abbiamo iniziato a scoprirlo ricercando un vero produttore giapponese – in questo caso Musibi, tessitura della città imperiale di Kyoto – e facendo una prima selezione di puro cotone (anche se i Furoshiki possono essere anche di rayon, seta e altre fibre).\nSono delle pezze da 100X100 cm circa, che consentono non solo di creare insolite borse in vari modelli e forme, ma anche di impacchettare doni di ogni genere con una stoffa che verrà poi ri-utilizzata, secondo la fantasia del fortunato che riceverà il regalo: come foulard, o fascia per capelli; come pacchetto estroso per una bottiglia o per dei fiori da portare a cena da amici. In tutti i casi, il regalo sarà doppio, perché questi cotoni sono super-curati e consegnati con un piccolo depliant su come utilizzarli nei modi più belli e fantasiosi.\nTutti i Furoshiki che abbiamo selezionato sono tinti in filo, non semplicemente stampati in serigrafia, e questo li rende non solo preziosi, ma anche estremamente resistenti ai lavaggi. Alcuni di loro sono anche double face e hanno la stessa fantasia riprodotta in modo speculare su entrambi i lati, ma in colori diversi. Nel caso delle borse, questo significa avere la possibilità di cambiare il proprio look in un solo gesto.\nborseFuroshikimanici MiyakoMusibiquiltingricamo sashikotessuti


Non c'è solidarietà senza conflitto - Jacobin Italia\nNon c’è solidarietà senza conflitto\nNiccolò Barca 23 Marzo 2020\nNell'era del There Is No Alternative le crisi hanno smesso di essere il momento atteso dai rivoluzionari e sono diventate occasione per mettere a tacere le lotte. Anche stavolta sarà così?\nLa crisi è sempre stata un oggetto del desiderio per la sinistra. La sua inevitabilità garantiva l’aprirsi di possibilità rivoluzionarie, infondeva ottimismo in tutti coloro che avevano fatto l’abitudine ad essere sconfitti. E persino anni dopo che gli insegnamenti di Marx avevano perso la loro centralità, ogni crisi veniva usata per scrivere epitaffi sulla fine del capitalismo. «Questa volta è quella vera».\n«E anche questa volta non era lei». Come scriveva Mark Fisher, la crisi del 2008, ben lontana dal provocare la fine del capitalismo, non ha fatto altro che confermare il mantra centrale del realismo capitalista: There Is No Alternative – Non vi è alternativa. Far crollare le banche? Impensabile. Trasferire denaro pubblico nelle tasche dei privati? Perché no.\nNon ci si accorgeva che nel frattempo il capitale era diventato un esperto nella gestione della crisi. Diceva Milton Friedman ai suoi Chicago Boys: «Se volete forzare un cambiamento, fate cominciare una crisi». In Cile queste parole vennero prese alla lettera. Altrove, si è trattato semplicemente di usare ogni crisi come un’opportunità, uno stato d’eccezione da usare a proprio vantaggio. In Russia funziona perfettamente: la ricchezza gestita da pochi nel nome della collettività viene da un giorno all’altra trasferita nelle mani di pochi per gestirla in nome di stessi. Una New Orleans devastata dall’uragano Katrina diventa un enorme laboratorio di privatizzazione del sistema educativo. Una crisi economica permette al Fondo Monetario Internazionale e alla Banca Mondiale di imporre rapporti di dipendenza coloniali in giro per il mondo. L’Aquila, 2009: «Stamattina alle 3:32 ridevo dentro al letto».\nOgni crisi apre una crepa tra le mura traballanti che tengono in piedi le nostre società. A volte quella crepa apre una prospettiva diversa attraverso la quale poter vedere quello che prima ci era nascosto. Fisher direbbe che ci permette di «Rilassare un certo tipo di paralisi mentale». Ma questo non comporta necessariamente alcun cambiamento. Più spesso che non, le crisi servono a legittimare ciò che le precedeva. Il caos trasforma l’ordine in qualcosa di desiderabile.\nSulle pagine dei grandi quotidiani, sulla televisione, attraverso le parole degli influencer (segno di una crisi di legittimità della classe politica); ovunque ci si appella apertamente o tra le righe ad un senso di solidarietà nazionale per una crisi che non fa distinguo di classe o del colore della pelle. Rafforzano quella supposta equivalenza tra governanti e governati attraverso la quale l’oligarchia si dichiara democrazia. «Siamo tutti sulla stessa barca». Sbandierano un ritorno alla normalità, e quindi ad un’Italia con più di 5 milioni di persone in povertà assoluta, in cui muoiono 3 persone al giorno sul posto di lavoro, in cui una casa su 4 è sfitta mentre per strada si moltiplicano i senza-tetto. Vogliono convincere che la paura di rimanere senza cibo o senza tetto – la miseria di un’esistenza passata all’insegna dell’incertezza – siano sintomi di un’emergenza e non l’emergenza stessa.\nE mentre ovunque piccoli e grandi gesti, volontarismo, contatti e flashmob ricordano il valore di un tessuto sociale sotto attacco da 30 anni di privatizzazione del publico, Confindustria litiga per evitare di fare il minimo indispensabile per garantire la sicurezza dei propri lavoratori. Amazon e Whole Foods chiedono ai propri dipendenti «sani» di donare il proprio congedo di malattia a quelli contagiati. Compagnie piene di liquidità licenziano i propri dipendenti perché questo è il momento di battere la concorrenza che soffre. Nei cieli volano solo i jet privati dei megaricchi. Maria Elena Boschi invita non si sa chi ad andare a riparare le buche di Roma: «Tanto stiamo tutti a casa».\nLa stessa sovrastante logica del profitto che detta questi comportamenti è alla base dell’incapacità di gestione della pandemia, i cui morti ci sono venduti come un fenomeno naturale e che invece sono conseguenza di decisioni politiche. La ricerca di un vaccino per il Sars-CoV-2 sarebbe ad uno stadio ben più avanzato se non avessero bloccato i fondi per lo studio della Sars nel momento in cui non aveva più un mercato. La cura dei malati sarebbe meno caotica se in Italia non avessero tagliato il numero di letti dai 9,22 ogni 1000 abitanti del 1980 ai 2,5 di oggi. 0\nRischiamo ancora una volta di raggrupparci intorno al corpo esangue sul lato della strada mentre il pirata di strada fugge inosservato. E mentre stiamo li a guardare, qualcuno ha distrutto e ricostruito la strada, il quartiere e la città. La chiusura dei confini, gli eserciti per strada, le corse ai supermercati: chi pensa che siano momenti eccezionali non ha ben chiaro cosa riserba un futuro fatto di emergenze climatiche. Non significa abbandonarsi al disfattismo. Al contrario, significa prendere questa crisi per quello che è: un divelamento. Tragico, ma pur sempre un disvelamento.\nOgni crisi apre un terreno di lotta tra forze che nessuna «solidarietà nazionale» può conciliare, tra un capitale sempre più esperto nella gestione di crisi e una maggioranza di persone per le quali ogni crisi non rappresenta che un nuovo tipo di sacrificio. Ma rispetto ad un mese fa qualcosa è cambiato. Programmi di investimento fino a ieri ritenuti impensabili vengono attuati in poche ore perché esiste la volontà politica di attuarli. Lo stato ovunque entra in gioco li dove il mercato aveva promesso di poter risolvere tutto. Ci si ricorda del valore dei beni pubblici, dell’importanza di certi lavori – l’infermiere, l’operaio – denigrati da un sistema che ricompensa chi «fa per se» mentre punisce chi fa per la collettività.\nUn certo tipo di paralisi mentale si è rilassata, ma non sembra esserci una forza politica capace di intuire la potenzialità di questa crisi e di articolarne le contraddizioni. La posta, come sempre, è alta. La paura dell’altro, la richiesta di sicurezza, un senso di tradimento verso l’Unione europea: la destra sovranista saprà sfruttare queste emozioni a proprio favore. Nel frattempo, la crisi di piccole imprese ovunque darà un’opportunità ai giganti di ampliare i propri monopoli; negli ultimi giorni Amazon ha assunto 100 mila persone. Infine, si apre uno spiraglio per certe forze politiche di mettere in atto un aumento senza precedenti di welfare statale pur mantenendo retoriche nazionaliste e xenofobe: una combinazione di progressivismo economico e conservatorismo sociale che dovrebbe far suonare campane di allarme a chiunque abbia un minimo di memoria storica. La posta, come sempre, è alta; se non si offre una lettura alternativa della crisi e come uscirne saremo costretti a guardare indietro e ammettere: «E anche questa volta non era lei».\nLa politica in quarantena Lorenzo Zamponi\nC’è vita nell’emergenza Giuliano Santoro


Testata giornalistica prenderebbe percentuale sugli incassi degli eventi. Verità o fantasia? Bisogna approfondire | Il Viterbese\nHome » Politica » Testata giornalistica prenderebbe percentuale sugli incassi degli eventi. Verità o fantasia? Bisogna approfondire\nSta destando curiosità in città la notizia diffusa dal sito cittapaese.it secondo il quale una nota “testata giornalistica locale sarebbe socia in affari con Comune e associazioni con una percentuale fissa sulla vendita dei biglietti per gli eventi”.\n“La notizia – scrive il direttore di cittapaese – corre in città da tempo, ma in questo periodo le voci sarebbero sempre più insistenti e disegnerebbero un panorama davvero inaudito e assai preoccupante per Viterbo. In pratica pare – sono boatos che provengono da più ambienti bene informati – che la testata giornalistica locale sarebbe socia di Comune e associazioni per quello che concerne gli eventi cittadini: la stessa testata pretenderebbe una percentuale (neanche bassa) sullo sbigliettamento delle serate e in cambio promuoverebbe di volta in volta l’evento di scena. Uno scenario davvero da brivido che vedrebbe promosse solo le rassegne disposte a versare percentuali sugli incassi e le altre tagliate fuori dalla promozione. Ma la domanda è: come farebbe Palazzo dei Priori a stringere accordi con un solo giornale, concedendogli addirittura la possibilità di entrare in società?”.\nNon sappiamo se l’informazione sia vera del tutto o solo in parte, oppure se sia destituita di ogni fondamento. D’altra parte, lo stesso direttore del sito, Pasquale Bottone, parla della necessità di indagare ancora per conoscere tutta la verità. Non sappiamo dunque se la sua testata, nel raccogliere i boatos, sia riuscita ad inquadrare il fenomeno nella sua interezza.\nDi sicuro, come sostiene sempre Bottone, la vicenda merita di essere approfondita molto attentamente. Nel frattempo, si attendono perciò precisazioni nel più breve tempo possibile dallo stesso Comune. E’ evidente infatti che se le circostanze venissero confermate, in tutto o in parte, si aprirebbe uno scenario degno di ben altre indagini rispetto a quelle che possono essere condotte solo a livello giornalistico.


Permesso di soggiorno per motivi umanitari, pronto il decreto per abolirlo - Secolo d'Italia\nPermesso di soggiorno per motivi umanitari, pronto il decreto per abolirlo\ngiovedì 6 settembre 13:47 - di Mariano Folgori\nMigranti, una nuova tempesta di polemiche si sta per abbattere sul governo. È infatti pronto il decreto voluto dal ministro dell’Interno Matteo Salvini che imita fortemente la concessione del permesso soggiorno per motivi umanitari. Il provvedimento, come si legge nella relazione illustrativa in possesso dell’Adnkronos, abroga di fatto tale istituto introducendo “una tipizzazione delle tipologie di tutela complementare”. Il provvedimento si giustifica per l’abnorme numero dei permessi di soggiorno, aumentati dall’inizio di quest’anno del 28%.\nTuttavia, “l’abrogazione dell’istituto del rilascio del permesso di soggiorno per motivi umanitari” determina “l’esigenza di individuare e dotare di apposita copertura normativa ipotesi eccezionali di tutela dello straniero”. Esigenze che, recita la relazione, “sono individuate nelle condizioni di salute di eccezionale gravità e nelle situazioni contingenti di calamità naturale nel Paese di origine che impediscono temporaneamente il rientro dello straniero in condizioni di sicurezza.\nIl provvedimento studiato da Salvini introduce anche norme più severe in tema di concessione della cittadinanza alla luce “dell’accresciuta minaccia terroristica internazionale e dei preoccupanti fenomeni di contraffazione dei documenti dei Paesi d’origine prodotti dai richiedenti”. Sempre in questo ambito, un’altra disposizione che farà sicuramente discutere è l’introduzione dell’istituto della revoca della cittadinanza italiana concessa ai cittadini stranieri che rappresentano una minaccia per la sicurezza nazionale”. Si tratta di soggetti che hanno “riportato condanne per gravi reati commessi con finalità di terrorismo o eversione”.\nGiorgio Piras 6 settembre 2018\nlogico e semplice\nConcorderei per la revoca della cittadinanza italiana anche per gli italiani immeritevoli !\nPer la faccenda documenti di identità…. agli stranieri provvederei con apposito documento/passaporto passivo (concesso con atto fiduciario a favore dell’immigrato nel quale si dichiara ”Residente straniero stabile (maroc) sul territorio nazionale e per i figli.. uguale ! Prima str***++ata ritiro passaporto/documento direttamente dall’agente invio in prefettura a mano del prefetto che almeno avrà qualcosa da fare !!!!\nfinché non vedo , non credo. Forza Meloni!


Canon Pixma Mp250 Pulizia » michianahotairballoonrides.com\nCome pulire le testine della stampante Salvatore Aranzulla.\nAvendo tra le mani diverse stampanti Canon in particolare una Canon Pixma ip3300, dopo anni di duro e onorato lavoro, si arriva al punto critico: una lucetta gialla circolare, sconosciuta e d’origine ignota, comincia a lampeggiare. Per la paura, provo a spegnerla.. 23/09/2016 · Come Pulire la Testina della Cartuccia di una Stampante. RICARICARE CARTUCCE INKJET BLACK PG-540 COLOR CL-541 CANON MG3600 [TUTORIAL. Pulizia manuale della testina di stampa sulla. Aprire la finestra delle impostazioni del driver della stampante. Fare clic su Pulizia Cleaning nella scheda Manutenzione Maintenance. Quando si apre la finestra di dialogo Pulizia testina di stampa Print Head Cleaning, selezionare il gruppo di serbatoi d'inchiostro da pulire. Fare clic su Elementi della verifica iniziale Initial Check Items per visualizzare gli elementi da controllare. 04/11/2017 · Come resettare il contatore dell’assorbitore dell’inchiostro in eccesso delle stampanti Canon. A volte i messaggi di errore e codici di errore della stampante sono dovuti alla spugna che. Resettare stampante Canon, codice reset stampante. Chi non possiede almeno una stampante in casa oppure in ufficio? Chiunque di noi ne adopera una e a volte ci capita di fare i conti con il classico blocco della stampante senza conoscere il vero motivo per il quale non è più in grado di stampare un file immagine o di testo. Infatti molto spesso capita che queste periferiche vadano in blocco.\nPulizia delle testine di stampa dal computer. Allineamento della posizione della testina di stampa dal computer. Utilizzare il computer per stampare il test di controllo degli ugelli. Impostazione della cartuccia di inchiostro da utilizzare. Pulizia dell'interno della macchina. Pulizia. Utilizzo del Cartucce Rigenerate Canon PG/CL Serie. Altra procedura per Canon Pixma serie MP e MX Nel caso delle stampanti multifunzioni canon serie Pixma MP e Pixma MX potete provare anche quest'altra procedura: 1 Spegnete la stampante se è accesa. MP250 MX300 MX310. 09/11/2012 · Riparazione fai da te in stampante A3 Canon S6300 relativa al problema del serbatoio di inchiostro in eccesso quasi pieno. Dovete sapere che tutte. I driver per Stampanti Canon per Windows ti aiuteranno a configurare i tuoi dispositivi e correggere gli errori. I driver gratuiti per Stampanti Canon sono raccolti dai siti Web ufficiali del produttore. DriverHub. Installa DriverHub e risolvi eventuali problemi con i driver. Cartucce e ricariche per Canon Pixma MP250 tante offerte e tante promozioni per la tua stampante inkjet.\ntestina stampante canon – Le migliori marche. Nella lista seguente troverai diverse varianti di testina stampante canon e recensioni lasciate dalle persone che lo hanno acquistato.Le varianti sono disposte per popolarità dal più popolare a quello meno popolare. Lista delle varianti di testina stampante canon. ho una Canon Pixma ip1700 che ha l’assorbitore dell’inchiostro pieno. Un anno fa l’ho portata da un tecnico e me l’ha riparata. Il problema si è presenato qualche settimana fa e glielo portata di nuovo. Dopo qualche giorno mi ha detto che il programma di resseter non. La Canon PG-512 compatibile con la Canon Pixma MP250 è garanzia di funzionamento e di stampe di altissima qualità. Puoi ridurre il costo di stampa, certo che la qualità ottenuta sarà identica alle cartucce Canon, rispettando la funzionalità delle stampanti che di norma impiegano queste cartucce.\nScarica gratis la guida per l'utente, le istruzioni d'uso e manuale utente Canon PIXMA MP250. Pagina 2 di 716. Come smontare e pulire la Testina di una Canon Pixma manualmente. admin Assistenza Stampante Canon, Assistenza Stampanti canon,. Ho una Canon pixma 6000d che andava benissimo ed è da parecchio che l’ho comprata ma ovviamente non usandola per.\nCome pulire le testine della stampante di Salvatore Aranzulla. o Epson, ti consiglio di consultare le mie guide dettagliate relative al download e all’installazione dei driver Canon, driver HP, driver Samsung e driver Epson. Se invece possiedi una stampante di marca diversa.\nadmin Assistenza Stampante Canon, Cartucce Canon testina integrata, Pulizia Testine Stampante Canon, Stampante Canon Pixma stampa male, Testina Canon, Testine Canon 4 Comments 136 Views Con questo articolo ritorniamo a parlare di uno dei problemi più ricorrenti nelle stampanti che utilizzano taniche di inchiostro a colori separati senza testina di stampa sulle quali resta quindi un pezzo.\nCanon pixma ts3351 multifunzione a getto d'inchiostro a colori stampa, scansione, copia, display LCD da 3,8 cm, wlan, app di stampa, 4800 x 1200 dpi, bianco Qualità e praticità: cartucce fine e formato XL opzionale Connettività semplice: app canon print, airprint ios e mopria android.\nStampanti Canon Pixmaassorbitore d’inchiostro pieno.\nCanon PIXMA MP230 Stampante Multifunzione 3in1 4800 x 1200 dpi, colore. non come le vecchie Epson Stylus Color che ogni volta dovevano "pulire le testine. una Canon Pixma MP250 dopo due anni di onorato servizio si è guastata per un problema di software interno per il quale non era conveniente portarla ad un centro assistenza.Per. 11/01/2017 · [Archivio] Canon Pixma MP250 Stampanti, scanner e altre periferiche di I/O. Riguardo la pulizia della testina - come già detto - ho passato un cotton fioc imbevuto d'alcol. Procedura di reset stampanti Canon: 1. Spegnere la stampante 2. premere e tenere premuto "RESUME", quindi accendere con ON tenendo premuti entrambi i tasti ON e RESUME 3. rilasciare solo il tasto RESUME tenendo sempre premuto ON 4. premere 2 volte il tasto RESUME, quindi rilasciare anche ON. Visita eBay per trovare una vasta selezione di testina canon mp 510. Scopri le migliori offerte, subito a casa, in tutta sicurezza.\nPulizia Cleaning Consente di eseguire la pulizia della testina di stampa. La funzione Pulizia testina di stampa consente di rimuovere eventuali ostruzioni dagli ugelli delle testine. Eseguire la pulizia quando la stampa diventa sbiadita o un colore specifico non viene stampato, anche se tutti i.\nCome pulire le cartucce e farle tornare funzionanti. Da pannello di controllo selezioniamo le opzioni della nostra stampante e avviamo “Pulizia della testina di stampa” e in seguito “Pulizia Accurata”, la stampante tenterà di pulire automaticamente gli ugelli impiegando qualche minuto.\nCartucce Canon Pixma MP230 ed inchiostri: su LaMiaStampante trovi consumabili compatibili inkjet, inchiostri per la ricarica della tua HP ed offerte di cartucce stampanti per Canon Pixma MP230; se clicchi l'immagine della cartuccia Canon o del prodotto visualizzato accedi alla pagina di dettaglio che LaMiaStampante mette a disposizione degli utenti per approfondimenti sulla qualità delle. 04/11/2013 · Bene, presa la testina nuova: puliziaallineamento = stampante resuscitata. Perfetto! Per chi avesse problemi analoghi, il codice del ricambio originale è QY6-0064 Tenetelo a mente, perché questa testina monta su parecchi modelli Canon, quindi se avete problemi analoghi e il costo vale la candela, risolvete. Se la cartuccia della stampante non funziona più e l' hai usata per brevissimo tempo, allora sicuramente sono le testine di stampa che si sono riempite di polvere e non riescono più a stampare. Nei passi a seguire scoprirete come pulire le testine della cartuccia di una stampante. Migliore stampante Canon: guida all’acquisto di Salvatore Aranzulla. Canon non ha bisogno di troppe presentazioni. Si tratta di una delle più famose e antiche aziende produttrici di stampanti e nel suo catalogo sono disponibili soluzioni atte a soddisfare un po’ tutte le tipologie di utenza, da quella casalinga a quella professionale.\nReset dell’assorbitore inchiostro stampanti Canon.\n06/02/2017 · Con questo video vi mostro come ricaricare le cartucce per stampante canon, in questo caso ne ho utilizzata una a colori. Molti praticano dei fori su queste. Sottopone a scansione il foglio con l'allineamento della testina di stampa per allinearla automaticamente. 1 Caricare il foglio con l'allineamento della testina di stampa sul piano di lettura in vetro. Caricare il foglio con l'allineamento della testina di stampa CON IL LATO STAMPATO RIVOLTO VERSO IL BASSO e allineare il segno nell'angolo inferiore destro del foglio con il segno di allineamento.


Praline di Cioccolato e Grappa 200g - Italcomerce\nPraline di Cioccolato e Grappa. Cioccolatini ripieni di grappa biologica Focu\nCOD: D011 Categorie: Alimentari, Dolci\nPraline di Cioccolato e Grappa\nUn’esperienza indimenticabile è quella che si vive gustando le praline di cioccolato ripiene di grappa biologica FOCU.\nIl sapore intenso e coinvolgente del cioccolato fondente si sposa alla perfezione con i profumi della grappa.\nIl guscio di queste praline è prodotto con cioccolato fondente con cacao al 61%, zucchero, pasta di cacao, burro di cacao, mentre il ripieno è grappa biologica FOCU al 13%, con acqua e zucchero.\nRecensisci per primo “Praline di Cioccolato e Grappa 200g” Annulla risposta