Proteina spike del Coronavirus
# Proteina spike del Coronavirus

La glicoproteina Spike (S) (a volte chiamata anche proteina spike, precedentemente nota come E2) è la più grande delle quattro principali proteine strutturali presenti nei coronavirus. La proteina spike si assembla in trimeri che formano grandi strutture, chiamate spike o peplomeri, che sporgono dalla superficie del virione. L'aspetto distintivo di questi picchi quando visualizzati utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione di colorazione negativa, "che ricorda la corona solare ", dà alla famiglia del virus il suo nome principale.

La funzione della glicoproteina spike è quella di mediare l'ingresso virale nella cellula ospite interagendo prima con le molecole sulla superficie cellulare esterna e poi fondendo le membrane virali e cellulari. La glicoproteina Spike è una proteina di fusione di classe I che contiene due regioni, note come S1 e S2, responsabili di queste due funzioni. La regione S1 contiene il dominio di legame al recettore che si lega ai recettori sulla superficie cellulare. I coronavirus utilizzano una gamma molto diversificata di recettori; SARS-CoV (che causa la SARS ) e SARS-CoV-2 (che causa COVID-19 ) interagiscono entrambi con l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2). La regione S2 contiene il peptide di fusione e altre infrastrutture di fusione necessarie per la fusione della membrana con la cellula ospite, un passaggio necessario per l'infezione e la replicazione virale. La glicoproteina Spike determina la gamma di ospiti del virus (quali organismi può infettare) e il tropismo cellulare (quali cellule o tessuti può infettare all'interno di un organismo).

Spike glicoproteina è altamente immunogenica. Anticorpi contro la glicoproteina spike sono stati trovati in pazienti guariti da SARS e COVID-19. Gli anticorpi neutralizzanti prendono di mira gli epitopi sul dominio di legame del recettore. La maggior parte degli sforzi di sviluppo del vaccino COVID-19 in risposta alla pandemia di COVID-19 mira ad attivare il sistema immunitario contro la proteina spike. La glicoproteina Spike non è il principale determinante della patogenicità, che sono altre proteine che restano da identificare, ma le sue mutazioni conferiscono al virus la capacità di eludere l'immunità.

## Struttura

La proteina spike è molto grande, spesso lunga 1200-1400 residui di aminoacidi; sono 1273 residui in SARS-CoV-2. È una proteina transmembrana a passaggio singolo con una breve coda C-terminale all'interno del virus, un'elica transmembrana e un grande ectodominio N-terminale esposto all'esterno del virus.

La glicoproteina Spike forma omotrimeri in cui tre copie della proteina interagiscono attraverso i loro ectodomini. Le strutture del trimero sono state descritte come clava-pera o a forma di petalo. Ogni proteina spike contiene due regioni note come S1 e S2, e nel trimero assemblato le regioni S1 all'estremità N-terminale formano la porzione della proteina più lontana dalla superficie virale mentre le regioni S2 formano un "gambo" flessibile contenente la maggior parte di le interazioni proteina-proteina che tengono in posizione il trimero.

### S1

La regione S1 della glicoproteina spike è responsabile dell'interazione con le molecole del recettore sulla superficie della cellula ospite nella prima fase dell'ingresso virale. S1 contiene due domini, chiamati dominio N-terminale (NTD) e dominio C-terminale (CTD), talvolta noti anche come domini A e B. A seconda del coronavirus, uno o entrambi i domini possono essere utilizzati come domini di legame al recettore (RBD). I recettori bersaglio possono essere molto diversi, comprese le proteine del recettore della superficie cellulare e gli zuccheri come gli acidi sialici come recettori o corecettori. In generale, il NTD lega le molecole di zucchero mentre il CTD lega le proteine, ad eccezione del virus dell'epatite murina che utilizza il suo NTD per interagire con un recettore proteico chiamato CEACAM1. Il NTD ha un ripiegamento proteico simile alla galectina, ma lega le molecole di zucchero in modo leggermente diverso rispetto alle galectine.

Il CTD è responsabile delle interazioni di MERS-CoV con il suo recettore dipeptidil peptidasi-4, e quelle di SARS-CoV e SARS-CoV-2 con il loro recettore dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2 ). Il CTD di questi virus può essere ulteriormente suddiviso in due sottodomini, noti come il core e l'ansa estesa o motivo di legame del recettore (RBM), dove si trova la maggior parte dei residui che contattano direttamente il recettore bersaglio. Ci sono sottili differenze, principalmente nell'RBM, tra le interazioni delle proteine spike SARS-CoV e SARS-CoV-2 con ACE2. I confronti delle proteine spike di più coronavirus suggeriscono che la divergenza nella regione RBM può spiegare le differenze nei recettori bersaglio, anche quando il nucleo del CTD S1 è strutturalmente molto simile.

All'interno dei lignaggi di coronavirus, così come nei quattro principali sottogruppi di coronavirus, la regione S1 è conservata meno bene di S2, come si addice al suo ruolo nell'interazione con i recettori delle cellule ospiti specifici del virus. All'interno della regione S1, il NTD è più altamente conservato del CTD.

### S2

La regione S2 della glicoproteina spike è responsabile della fusione della membrana tra l' involucro virale e la cellula ospite, consentendo l'ingresso del genoma del virus nella cellula. La regione S2 contiene il peptide di fusione, un tratto di aminoacidi per lo più idrofobici la cui funzione è quella di entrare e destabilizzare la membrana della cellula ospite. S2 contiene anche due sottodomini ripetuti a gruppi di sette noti come HR1 e HR2, a volte chiamati regione "nucleo di fusione". Questi sottodomini subiscono drammatici cambiamenti conformazionali durante il processo di fusione per formare un fascio di sei eliche, una caratteristica delle proteine di fusione di classe I. Si ritiene inoltre che la regione S2 includa l' elica transmembrana e la coda C-terminale situata all'interno del virione.

Rispetto a S1, la regione S2 è molto ben conservata tra i coronavirus.

### Modifiche post-traduzionali

La glicoproteina Spike è fortemente glicosilata attraverso la glicosilazione legata all'N. Gli studi sulla proteina spike SARS-CoV-2 hanno anche riportato glicosilazione O-linked nella regione S1. La coda C-terminale, situata all'interno del virione, è arricchita di residui di cisteina ed è palmitoilata.

Le proteine spike vengono attivate attraverso la scissione proteolitica. Sono scissi dalle proteasi della cellula ospite al confine S1-S2 e successivamente in quello che è noto come sito S2' all'N-terminale del peptide di fusione.

### Cambiamento conformazionale

Come altre proteine di fusione di classe I, la proteina spike subisce un cambiamento conformazionale molto ampio durante il processo di fusione. Entrambi gli stati pre-fusione e post-fusione di diversi coronavirus, in particolare SARS-CoV-2, sono stati studiati mediante microscopia crioelettronica. Sono state osservate anche dinamiche proteiche funzionalmente importanti all'interno dello stato di pre-fusione, in cui gli orientamenti relativi di alcune delle regioni S1 rispetto a S2 in un trimero possono variare. Nello stato chiuso, tutte e tre le regioni S1 sono ravvicinate e la regione che entra in contatto con i recettori della cellula ospite è stericamente inaccessibile, mentre gli stati aperti hanno uno o due RBD S1 più accessibili per il legame del recettore, in una conformazione aperta o "up".

## Espressione e localizzazione

Il gene che codifica per la proteina spike si trova verso l' estremità 3' del genoma dell'RNA a senso positivo del virus, insieme ai geni per le altre tre proteine strutturali e varie proteine accessorie specifiche del virus. Il traffico proteico delle proteine spike sembra dipendere dal sottogruppo del coronavirus: quando espresse in isolamento senza altre proteine virali, le proteine spike dei betacoronavirus sono in grado di raggiungere la superficie cellulare, mentre quelle degli alfacoronavirus e dei gammacoronavirus vengono trattenute a livello intracellulare. In presenza della proteina M, il traffico della proteina spike viene alterato e viene invece trattenuto nell'ERGIC, il sito in cui si verifica l'assemblaggio virale. In SARS-CoV-2, sia la proteina M che la proteina E modulano il traffico di proteine spike attraverso meccanismi diversi.

La proteina spike non è necessaria per l'assemblaggio virale o la formazione di particelle simili a virus; tuttavia, la presenza di spike può influenzare la dimensione dell'involucro. L'incorporazione della proteina spike nei virioni durante l'assemblaggio e il germogliamento dipende dalle interazioni proteina-proteina con la proteina M attraverso la coda C-terminale. L'esame dei virioni mediante microscopia crioelettronica suggerisce che ci sono approssimativamente da 25 a 100 trimeri di spike per virione.

## Funzione

La proteina spike è responsabile dell'ingresso del virus nella cellula ospite, un passaggio iniziale necessario nella replicazione virale. È essenziale per la riproduzione. Svolge questa funzione in due fasi: prima legandosi a un recettore sulla superficie della cellula ospite attraverso le interazioni con la regione S1; poi fondendo le membrane virale e cellulare attraverso l'azione della regione S2. La posizione della fusione varia a seconda del coronavirus specifico: alcuni sono in grado di entrare nella membrana plasmatica; altri entrano dagli endosomi dopo l'endocitosi.

### Attaccamento

L'interazione del dominio di legame del recettore nella regione S1 con il suo recettore bersaglio sulla superficie cellulare avvia il processo di ingresso virale. Diversi coronavirus prendono di mira diversi recettori della superficie cellulare, a volte utilizzando molecole di zucchero come gli acidi sialici o formando interazioni proteina-proteina con proteine esposte sulla superficie cellulare. Diversi coronavirus variano ampiamente nel loro recettore bersaglio. La presenza di un recettore bersaglio che S1 può legare è un fattore determinante del range dell'ospite e del tropismo cellulare.

Coronavirus umani e loro recettori sulla superficie cellulare :

| Specie | Genere | Recettore | Riferimento |
| - | - | - | - |
| Coronavirus umano 229E | Alfacoronavirus | Aminopeptidasi N | [3] [27] |
| Coronavirus umano NL63 | Alfacoronavirus | Enzima di conversione dell'angiotensina 2 | [3] [28] |
| Coronavirus umano HKU1 | Betacoronavirus | Acido N-acetil-9-O-acetilneuraminico | [26] [29] |
| Coronavirus umano OC43 | Betacoronavirus | Acido N-acetil-9-O-acetilneuraminico | [3] [30] |
| Coronavirus correlato alla sindrome respiratoria mediorientale | Betacoronavirus | Dipeptidil peptidasi-4 | [3] [31] |
| Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus | Betacoronavirus | Enzima di conversione dell'angiotensina 2 | [3] [32] |
| Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 | Betacoronavirus | Enzima di conversione dell'angiotensina 2 | [4] [8] |

### Scissione proteolitica

La scissione proteolitica della proteina spike, talvolta nota come "priming", è necessaria per la fusione della membrana. Rispetto ad altre proteine di fusione di classe I, questo processo è complesso e richiede due scissioni in siti diversi, uno al confine S1/S2 e uno al sito S2' per rilasciare il peptide di fusione. I coronavirus variano a seconda di quale parte del ciclo di vita virale si verificano queste scissioni, in particolare la scissione S1/S2. Molti coronavirus vengono scissi in S1/S2 prima dell'uscita virale dalla cellula produttrice del virus, dalla furina e da altre proprotein convertasi; in SARS-CoV-2 in questa posizione è presente un sito di scissione della furina polibasica. Altri possono essere scissi da proteasi extracellulari come l'elastasi, da proteasi situate sulla superficie cellulare dopo il legame del recettore o da proteasi trovate nei lisosomi dopo l'endocitosi. Le proteasi specifiche responsabili di questa scissione dipendono dal virus, dal tipo di cellula e dall'ambiente locale. In SARS-CoV, la serina proteasi TMPRSS2 è importante per questo processo, con ulteriori contributi delle proteasi della cisteina catepsina B e catepsina L negli endosomi. È stato segnalato che anche la tripsina e le proteasi simili alla tripsina contribuiscono. In SARS-CoV-2, TMPRSS2 è la proteasi primaria per la scissione di S2 'e la sua presenza è segnalata come essenziale per l'infezione virale, con la catepsina L proteasi funzionale, ma non essenziale.

### Fusione di membrana

Come altre proteine di fusione di classe I, la proteina spike nella sua conformazione pre-fusione è in uno stato metastabile. Viene attivato un drammatico cambiamento conformazionale per indurre le ripetizioni dell'eptade nella regione S2 a ripiegarsi in un fascio esteso di sei eliche, facendo interagire il peptide di fusione con la membrana cellulare e portando le membrane virali e cellulari in stretta vicinanza. Sono necessari il legame del recettore e la scissione proteolitica (a volte nota come "priming"), ma ulteriori fattori scatenanti per questo cambiamento conformazionale variano a seconda del coronavirus e dell'ambiente locale. Studi in vitro di SARS-CoV suggeriscono una dipendenza dalla concentrazione di calcio. Insolitamente per i coronavirus, il virus della bronchite infettiva, che infetta gli uccelli, può essere scatenato solo dal basso pH; per altri coronavirus, il basso pH non è di per sé un fattore scatenante, ma può essere necessario per l'attività delle proteasi, che a loro volta sono necessarie per la fusione. La posizione della fusione della membrana, sulla membrana plasmatica o negli endosomi, può variare in base alla disponibilità di questi fattori scatenanti per il cambiamento conformazionale. La fusione delle membrane virali e cellulari consente l'ingresso del genoma dell'RNA di senso positivo del virus nel citosol della cellula ospite, dopodiché inizia l'espressione delle proteine virali.

Oltre alla fusione delle membrane cellulari virali e ospiti, alcune proteine del picco del coronavirus possono avviare la fusione della membrana tra cellule infette e cellule vicine, formando sincizi. Questo comportamento può essere osservato nelle cellule infette in coltura cellulare. I sincizi sono stati osservati nei campioni di tessuto dei pazienti da infezioni da SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2, sebbene alcuni rapporti evidenzino una differenza nella formazione dei sincizi tra i picchi SARS-CoV e SARS-CoV-2 attribuito a differenze di sequenza vicino al sito di clivaggio S1/S2.

### Immunogenicità

Poiché è esposta sulla superficie del virus, la proteina spike è un importante antigene verso il quale vengono sviluppati anticorpi neutralizzanti. La sua ampia glicosilazione può fungere da scudo glicano che nasconde gli epitopi dal sistema immunitario. A causa dello scoppio della SARS e della pandemia di COVID-19, gli anticorpi contro le proteine spike SARS-CoV e SARS-CoV-2 sono stati ampiamente studiati. Sono stati identificati anticorpi contro le proteine spike SARS-CoV e SARS-CoV-2 che prendono di mira gli epitopi sul dominio di legame del recettore o interferiscono con il processo di cambiamento conformazionale. La maggior parte degli anticorpi degli individui infetti prende di mira il dominio di legame al recettore.

## Risposta COVID-19

### Vaccini

In risposta alla pandemia di COVID-19, sono stati sviluppati numerosi vaccini COVID-19 utilizzando una varietà di tecnologie, inclusi i vaccini a mRNA e i vaccini a vettore virale. La maggior parte dello sviluppo del vaccino ha preso di mira la proteina spike. Basandosi su tecniche precedentemente utilizzate nella ricerca sui vaccini mirata al virus respiratorio sinciziale e SARS-CoV, molti sforzi di sviluppo del vaccino SARS-CoV-2 hanno utilizzato costrutti che includono mutazioni per stabilizzare la conformazione pre-fusione della proteina spike, facilitando lo sviluppo di anticorpi contro gli epitopi esposti in questa conformazione.

Secondo uno studio pubblicato nel gennaio 2023, nelle persone che hanno sviluppato miocardite post-vaccino (rispetto ai controlli che sono rimasti sani), sono stati trovati livelli marcatamente elevati di proteina spike a lunghezza intera non legata dagli anticorpi.

### Anticorpi monoclonali

Gli anticorpi monoclonali che prendono di mira la proteina spike sono stati sviluppati come trattamenti COVID-19. A partire dall'8 luglio 2021, tre prodotti a base di anticorpi monoclonali avevano ricevuto l'autorizzazione all'uso di emergenza negli Stati Uniti: bamlanivimab/etesevimab, casirivimab/imdevimab, e sotrovimab . Bamlanivimab/etesevimab non è stato raccomandato negli Stati Uniti a causa dell'aumento delle varianti di SARS-CoV-2 che sono meno sensibili a questi anticorpi.

### Varianti SARS-CoV-2

Durante la pandemia COVID-19, il genoma dei virus SARS-CoV-2 è stato sequenziato molte volte, con conseguente identificazione di migliaia di varianti distinte. Molti di questi possiedono mutazioni che cambiano la sequenza aminoacidica della proteina spike. In un'analisi dell'Organizzazione mondiale della sanità del luglio 2020, il gene spike (S) è stato il secondo più frequentemente mutato nel genoma, dopo ORF1ab (che codifica la maggior parte delle proteine non strutturali del virus). Il tasso di evoluzione nel gene spike è superiore a quello osservato nel genoma in generale. Le analisi dei genomi SARS-CoV-2 suggeriscono che alcuni siti nella sequenza della proteina spike, in particolare nel dominio di legame del recettore, sono di importanza evolutiva e sono in fase di selezione positiva.

Le mutazioni della proteina Spike destano preoccupazione perché possono influenzare l'infettività o la trasmissibilità o facilitare la fuga immunitaria. La mutazione D 614 G è sorta indipendentemente in più linee virali ed è diventata dominante tra i genomi sequenziati; può avere vantaggi in termini di infettività e trasmissibilità probabilmente a causa dell'aumento della densità dei picchi sulla superficie virale, aumentando la proporzione di conformazioni competenti per il legame o migliorando la stabilità, ma non influisce sui vaccini. La mutazione N501Y è comune alle varianti Alpha, Beta, Gamma e Omicron di SARS-CoV-2 e ha contribuito a migliorare l'infezione e la trasmissione, a ridurre l'efficacia del vaccino e la capacità di SARS-CoV-2 di infettare nuove specie di roditori. La mutazione P681R altera il sito di clivaggio della furina ed è stata responsabile dell'aumento dell'infettività, della trasmissione e dell'impatto globale della variante SARS-CoV-2 Delta. Le mutazioni in posizione E 484, in particolare E484K, sono state associate alla fuga immunitaria e al legame anticorpale ridotto.

La variante SARS-CoV-2 Omicron è nota per avere un numero insolitamente elevato di mutazioni nella proteina spike. La mutazione 69–70del (Δ69-70) del gene spike SARS CoV-2 (gene S, gene-S) fa sì che una sonda del test PCR TaqPath non si leghi al bersaglio del gene S, portando al fallimento del bersaglio del gene S (SGTF) nella SARS Campioni positivi al CoV-2. Questo effetto è stato utilizzato come marcatore per monitorare la propagazione della variante Alpha e della variante Omicron.

### Ruolo chiave aggiuntivo nella malattia

Nel 2021, Circulation Research e Salk hanno condotto un nuovo studio che dimostra che il COVID-19 può essere anche una malattia vascolare, non solo respiratoria. Gli scienziati hanno creato uno "pseudovirus", circondato da proteine del picco SARS-CoV-2 ma senza alcun virus reale. E lo pseudovirus ha provocato danni ai polmoni e alle arterie dei modelli animali. Mostra che la proteina spike SARS-CoV-2 da sola può causare malattie vascolari e potrebbe spiegare alcuni pazienti covid-19 che hanno sofferto di ictus o altri problemi vascolari in altre parti del corpo umano allo stesso tempo. Il team ha replicato il processo rimuovendo le capacità di replicazione del virus e ha mostrato nuovamente lo stesso effetto dannoso sulle cellule vascolari.

### Disinformazione

Durante la pandemia di COVID-19, la disinformazione anti-vaccinazione su COVID-19 è circolata sulle piattaforme dei social media relative al ruolo della proteina spike nei vaccini COVID-19 . Si diceva che le proteine Spike fossero pericolosamente " citotossiche " e che i vaccini a mRNA che le contenevano fossero quindi di per sé pericolosi. Le proteine Spike non sono citotossiche o pericolose. Si diceva anche che le proteine spike fossero "sparse" dalle persone vaccinate, in un'allusione errata al fenomeno della diffusione virale indotta dal vaccino, che è un raro effetto dei vaccini con virus vivi a differenza di quelli usati per COVID-19. Lo "spargimento" delle proteine spike non è possibile.

## Evoluzione, conservazione e ricombinazione

Si ritiene che le proteine di fusione di classe I, un gruppo i cui esempi ben caratterizzati includono la proteina spike del coronavirus, l'emoagglutinina del virus dell'influenza e l'HIV Gp41, siano evolutivamente correlate. La regione S2 della proteina spike responsabile della fusione della membrana è più altamente conservata della regione S1 responsabile delle interazioni del recettore. La regione S1 sembra aver subito una significativa selezione diversificante.

All'interno della regione S1, il dominio N-terminale (NTD) è più conservato del dominio C-terminale (CTD). Il ripiegamento proteico simile alla galectina del NTD suggerisce una relazione con proteine cellulari strutturalmente simili da cui potrebbe essersi evoluto attraverso la cattura del gene dall'ospite. È stato suggerito che il CTD potrebbe essersi evoluto dal NTD per duplicazione genica. La posizione esposta in superficie del CTD, vulnerabile al sistema immunitario dell'ospite, può porre questa regione sotto un'elevata pressione selettiva. I confronti delle strutture di diversi CTD di coronavirus suggeriscono che potrebbero essere sottoposti a selezione diversificante e in alcuni casi, coronavirus lontanamente imparentati che utilizzano lo stesso recettore della superficie cellulare possono farlo attraverso un'evoluzione convergente.

