Ibridazione genomica comparativa
# Ibridazione genomica comparativa

L'ibridazione genomica comparativa (in sigla dall'inglese: CGH) è un metodo citogenetico molecolare per analizzare le variazioni del numero di copie (CNV) relative al livello di ploidia nel DNA di un campione da testare rispetto a un campione di riferimento, senza la necessità di colture di cellule. Lo scopo di questa tecnica è di confrontare in modo rapido ed efficiente due campioni di DNA genomico derivanti da due fonti, che sono spesso strettamente correlate, che si sospetta che contengano differenze in termini di guadagni o perdite di interi cromosomi o di regioni subcromosomiche (una porzione di un intero cromosoma). Questa tecnica è stata originariamente sviluppata per la valutazione delle differenze tra i complementi cromosomici del tumore solido e del tessuto normale, e ha una risoluzione migliorata di 5-10 megabasi rispetto alle più tradizionali tecniche di analisi citogenetica del bendaggio G (giemsa banding) e dell'ibridazione fluorescente in situ (FISH) che sono limitate dalla risoluzione del microscopio utilizzato.

Ciò si ottiene attraverso l'uso dell'ibridazione in situ a fluorescenza competitiva. In breve, ciò comporta innanzitutto l'isolamento del DNA dalle due sorgenti da confrontare, più comunemente una sorgente di test e una di riferimento, l'etichettatura di ciascun campione di DNA con fluorofori (molecole fluorescenti) di diversi colori (solitamente uno rosso e l'altro verde), la denaturazione del DNA in modo che sia a filamento singolo e l'ibridazione dei due campioni risultanti in un rapporto 1:1 con una normale diffusione in metafase dei cromosomi, a cui i campioni di DNA etichettati si legheranno nel loro locus di origine. Utilizzando un microscopio a fluorescenza e un software, i segnali fluorescenti di differente colore vengono confrontati lungo la lunghezza di ciascun cromosoma per l'identificazione delle differenze cromosomiche tra le due sorgenti. Una maggiore intensità del colore del campione da testare in una specifica regione di un cromosoma indica il guadagno di materiale in quella regione, mentre una maggiore intensità del colore del campione di riferimento indica la perdita di materiale nel campione in quella specifica regione. Un colore neutro (giallo, quando le etichette dei fluorofori sono rosse e verdi) indica che non è presente nessuna differenza tra i due campioni in quella posizione.

Il CGH è in grado di rilevare solo alterazioni cromosomiche sbilanciate. Questo perché anomalie cromosomiche bilanciate come traslocazioni reciproche, inversioni o cromosomi ad anello non influiscono sul numero di copie, che è ciò che viene rilevato dalle tecnologie CGH. La CGH, tuttavia, consente l'esplorazione di tutti i 46 cromosomi umani in un unico test e la scoperta di delezioni e duplicazioni, anche su scala microscopica, che possono portare all'identificazione di geni candidati da esplorare ulteriormente con altre tecniche citologiche.

Attraverso l'uso di microarray di DNA, in combinazione con le tecniche CGH, è stata sviluppata la forma più specifica di array CGH (aCGH), che consente una misura locus per locus delle CNV con una risoluzione aumentata fino a 100 kilobasi. Questa tecnica così migliorata consente di scoprire l'eziologia di condizioni note e sconosciute.

## Storia

La motivazione alla base dello sviluppo del CGH derivava dal fatto che le forme di analisi citogenetica disponibili all'epoca (giemsa banding e FISH) erano limitate nella loro potenziale risoluzione dai microscopi necessari all'interpretazione dei risultati da essi forniti. Inoltre, l'interpretazione delle bande Giemsa ha il potenziale per essere ambigua e quindi l'affidabilità era ridotta. Inoltre, entrambe le tecniche richiedono input di manodopera elevati che limitano i luoghi in cui possono essere esaminati.

Il primo rapporto sull'analisi del CGH è stato nel 1992 presso l'Università della California dove Kallioniemi et al. hanno utilizzato il CGH nell'analisi dei tumori solidi. Hanno raggiunto questo obiettivo applicando direttamente la tecnica sia alle linee cellulari di cancro al seno che ai tumori primari della vescica al fine di analizzare il cariotipo completo di queste cellule. Sono stati in grado di identificare 16 diverse regioni di amplificazione, molte delle quali erano nuove scoperte.

Subito dopo, nel 1993, du Manoir et al. hanno riportato praticamente la stessa metodologia. Gli autori hanno etichettato una serie di singoli cromosomi umani da una libreria di DNA con due diversi fluorofori in proporzioni diverse per testare la tecnica, e hanno anche applicato CGH al DNA genomico di pazienti affetti da sindrome di Down o leucemia prolinfocitica a cellule T, nonché cellule di una linea cellulare di carcinoma papillare renale. Si è concluso che i rapporti di fluorescenza ottenuti erano accurati e che erano rilevabili differenze tra il DNA genomico di diversi tipi cellulari e quindi che il CGH era uno strumento di analisi citogenetica molto utile.

Inizialmente, l'uso diffuso della tecnologia CGH è stato difficoltoso, in quanto i protocolli non erano uniformi e sono emerse incongruenze, soprattutto per l'incertezza sull'interpretazione dei dati. Tuttavia, nel 1994 è stata pubblicata una revisione che descriveva in dettaglio un protocollo di facile comprensione ed è stato reso disponibile in commercio il software di analisi delle immagini, che ha consentito l'utilizzo del CGH in tutto il mondo. Quando nuove tecniche come la microdissezione e la reazione a catena della polimerasi innescata con oligonucleotidi degenerati (DOP-PCR) sono diventate disponibili per la generazione di prodotti del DNA, è stato possibile applicare il concetto di CGH ad anomalie cromosomiche più piccole e quindi la risoluzione di CGH è stata migliorata.

L'implementazione dell'array CGH, in cui sono utilizzati i microarray di DNA al posto della tradizionale preparazione dei cromosomi in metafase, è stata sperimentata da- Tolodo et al. nel 1997 utilizzando cellule tumorali e Pinkel et al. nel 1998, mediante l'uso di cellule di cancro al seno. Ciò è stato reso possibile grazie Progetto Genoma Umano che ha generato una libreria di frammenti di DNA clonati con posizioni note in tutto il genoma umano, utilizzati come sonde per il microarray di DNA. Ora i microarray di DNA possono contenere fino a 2 milioni di sonde di varia origine come cDNA, i prodotti della PCR genomica e cromosomi artificiali batterici (BAC). L'array CGH è un processo automatizzato, consente una risoluzione maggiore (fino a 100 kb) rispetto al CGH tradizionale poiché le sonde sono molto più piccole rispetto a i campioni bloccati in metafase, richiedono quantità minori di DNA, se necessario possono essere mirate a specifiche regioni cromosomiche, ed è ordinato e quindi più veloce da analizzare, rendendolo molto più adattabile agli usi diagnostici.

## Metodi di base

### Preparazione del vetrino in metafase

Il DNA sul vetrino è un campione di riferimento ed è quindi ottenuto da un uomo o una donna cariotipicamente normale, sebbene sia preferibile utilizzare il DNA femminile poiché sono presenti due cromosomi X che contengono molte più informazioni genetiche rispetto al cromosoma Y maschile. Vengono utilizzati linfociti del sangue periferico stimolati con fitoemoagglutinina. 1 ml di sangue eparinizzato viene aggiunto a 10 ml di terreno di coltura e incubato per 72 ore a 37 °C in un'atmosfera al 5% di CO $_2$ . La colchicina viene aggiunta per arrestare le cellule nella mitosi, le cellule vengono quindi raccolte e trattate con cloruro di potassio ipotonico e fissate in metanolo / acido acetico. in proporzione 3:1

Una goccia della sospensione cellulare deve essere lasciata cadere su un vetrino pulito con etanolo da una distanza di circa 30 cm, in condizioni ottimali questo dovrebbe essere effettuato a temperatura ambiente e con livelli di umidità del 60–70%. I vetrini devono essere valutati utilizzando un microscopio a contrasto di fase, è necessario osservare il citoplasma minimo e i cromosomi non devono sovrapporsi ed essere lunghi 400-550 bande senza cromatidi separati e infine dovrebbero apparire scuri piuttosto che lucidi. I vetrini devono poi essere asciugati all'aria per una notte a temperatura ambiente e qualsiasi ulteriore conservazione dovrebbe avvenire in gruppi di quattro a -20 °C con perline di silice o azoto per mantenere la secchezza. Dovrebbero essere testati diversi donatori poiché l'ibridazione può essere variabile. È possibile utilizzare vetrini disponibili in commercio, ma devono essere sempre prima testati.

### Isolamento del DNA dal tessuto di prova e dal tessuto di riferimento

Per ottenere il DNA dal test o dal tessuto di riferimento (individuo cariotipicamente normale), viene utilizzata l'estrazione standard del fenolo che comporta la combinazione di acido tris - etilendiamminotetraacetico e fenolo con DNA acquoso in quantità uguali. Segue la separazione mediante agitazione e centrifugazione, dopodiché lo strato acquoso viene rimosso e ulteriormente trattato utilizzando etere e infine viene utilizzata la precipitazione con etanolo per concentrare il DNA.

Può essere completato utilizzando kit di isolamento del DNA disponibili in commercio basati su colonne di affinità.

Preferibilmente, il DNA dovrebbe essere estratto da un tessuto fresco o congelato poiché questo sarà della massima qualità, sebbene ora sia possibile utilizzare anche materiale d'archivio fissato in formalina o incluso in cera di paraffina, a condizione che vengano seguite le procedure appropriate. 0,5-1 μg di DNA sono sufficienti per l'esperimento CGH, anche se se non si ottiene la quantità desiderata è possibile applicare la DOP-PCR per amplificare il DNA, tuttavia in questo caso è importante applicare la DOP-PCR sia al test che ai campioni di DNA di riferimento per migliorare l'affidabilità.

### Etichettatura del DNA

Per etichettare il DNA viene utilizzata la Nick translation che comporta il taglio del DNA e la sostituzione di nucleotidi etichettati con fluorofori (etichettatura diretta) o biotina o ossigenina per aggiungere successivamente anticorpi coniugati con fluoroforo (etichettatura indiretta). Dopodiché è importante controllare le lunghezze dei frammenti, sia del test sia del DNA di riferimento, mediante elettroforesi su gel, poiché per un'ibridazione ottimale dovrebbero rientrare nell'intervallo di 500 kb-1500 kb.

### Blocco

Il DNA Cot-1 (DNA placentare arricchito con sequenze ripetitive di lunghezza 50 bp-100 bp) di Life Technologies Corporation non etichettato viene aggiunto per bloccare le normali sequenze di DNA ripetitive, in particolare ai centromeri e ai telomeri, poiché queste sequenze, se rilevate, possono ridurre il rapporto di fluorescenza e causare guadagni o perdite per sfuggire al rilevamento.

### Ibridazione

Vengono mescolati 8–12μl di DNA del campione da testare con un uguale quantità di DNA di controllo e vengono aggiunti 40 μg di DNA Cot-1, dopo la precipitazione vengono sciolti in 6μl della miscela di ibridazione, che contiene il 50% di formammide, per ridurre la temperatura di fusione del DNA, e il 10% di destrano solfato per aumentare la concentrazione effettiva della sonda in una soluzione salina di citrato di sodio (SSC) a un pH di 7,0.

La denaturazione del vetrino e delle sonde viene eseguita separatamente. Il vetrino viene immerso in formammide al 70%/2xSSC per 5-10 minuti a 72 °C, mentre le sonde vengono denaturate per immersione in un bagno d'acqua di 80 °C per 10 minuti e vengono aggiunte immediatamente alla preparazione del vetrino in metafase. Questa reazione viene quindi coperta con un vetrino coprioggetto e lasciata per due o quattro giorni in una camera umida a 40 °C.

Il vetrino coprioggetto viene quindi rimosso e vengono applicati lavaggi di 5 minuti, tre utilizzando 2xSSC a temperatura ambiente, uno a 45 °C con 0,1xSSC e uno con TNT a temperatura ambiente. La reazione viene quindi preincubata per 10 minuti, quindi seguita da 60 minuti, 37 Incubazione in gradi centigradi, altri tre lavaggi di 5 minuti con TNT, quindi uno con 2xSSC a temperatura ambiente. Il vetrino viene quindi asciugato utilizzando etanolo in diverse concentrazioni, al 70%/96%/100%, prima della colorazione di contrasto con DAPI (0,35 µg/ml) per l'identificazione del cromosoma, infine la sigillatura con un vetrino coprioggetto.

### Visualizzazione della fluorescenza e imaging

Per la visualizzazione è necessario un microscopio a fluorescenza, con i filtri appropriati per la colorazione DAPI, e i due fluorofori utilizzati. Questi filtri dovrebbero anche ridurre al minimo la diafonia tra i fluorofori, come i filtri passa banda stretta. Il microscopio deve fornire un'illuminazione uniforme senza variazioni cromatiche, essere opportunamente allineato e avere un obiettivo di tipo "piano" apocromatico e dare un ingrandimento di x63 o x100.

L'immagine deve essere registrata utilizzando una telecamera con risoluzione spaziale di almeno 0,1 μm a livello del campione e fornire un'immagine di almeno 600x600 pixel. La telecamera deve inoltre essere in grado di integrare l'immagine per almeno 5-10 secondi, con una risoluzione fotometrica minima di 8 bit.

Un software CGH dedicato è disponibile in commercio per la fase di elaborazione delle immagini ed è necessario per sottrarre il rumore di fondo, rimuovere e segmentare materiali non di origine cromosomica, normalizzare il rapporto di fluorescenza, eseguire cariotipizzazione interattiva e ridimensionamento cromosomico alla lunghezza standard. Un "cariotipo del numero di copie relativo" che presenta aree cromosomiche di delezioni o amplificazioni viene generato calcolando la media dei rapporti di un numero di metafasi di alta qualità e tracciandoli lungo un ideogramma, un diagramma che identifica i cromosomi in base a modelli di bande. L'interpretazione dei profili di rapporto è condotta utilizzando soglie fisse o statistiche (intervalli di confidenza). Quando si utilizzano intervalli di confidenza, i guadagni o le perdite vengono identificati quando il 95% del rapporto di fluorescenza non contiene 1,0.

