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1. IntroductionDepuis près de dix ans, les travaux réalisés sur les Helminthes parasites intestinaux conservés dans les sites archéologiques ont évolué de manière importante, essentiellement en matière de traitement et d’interprétation des résultats. Mais les études restent incomplètes car une partie non négligeable de la parasitologie, les unicellulaires (Protozoaires et Flagellés), renfermant les éléments les plus pathogènes des maladies parasitaires, était jusqu’ici très peu abordée. En effet, les témoins fossiles des unicellulaires parasites, en contextes archéologiques, sont rarement observés en microscopie optique. Le peu de résultats et de travaux publiés en est la preuve (Witemberg, 1961 ; Fouant et al., 1982 ; Faulkner et al., 1989 ; Ferreira et al., 1992 ; Allison et al., 1999 ; Hidalgo-Arguello et al., 2003). Mauvaise conservation, difficultés d’observation, mais surtout techniques de recherche inadaptées au matériel fossile, sont la cause de cette déficience.Afin d’élargir l’éventail des connaissances sur la répartition et l’évolution des protozoonoses à travers le temps et l’espace, une étude exhaustive a été réalisée sur des échantillons archéologiques d’époques et de localisations géographiques différentes. Le matériel d’étude est composé d’échantillons de fèces fossiles (coprolithes), ou de sédiments contenant de la matière fécale conservée. Il était donc logique de travailler sur des parasites unicellulaires intestinaux. Parmi les nombreuses protozoonoses pouvant affecter l’homme, c’est l’amibe pathogène Entamoeba histolytica qui a été privilégiée pour ce travail. Ce choix s’est imposé de lui-même du fait de l’importance médicale actuelle de ce protozoaire, responsable d’environ un milliard de cas dans le monde et d’un million de décès chaque année. Pour finaliser cette recherche, l’outil immunologique a été choisi. Ces dernières années, des kits ont été mis à disposition, non plus orientés contre les anticorps sérologiques produits par l’hôte contre les pathogènes, mais directement contre les antigènes des parasites, présents à la surface des kystes des unicellulaires. Ces outils permettent par conséquent de mettre en évidence les protozoaires parasites intestinaux humains dans les échantillons de matière fécale et, potentiellement, dans du matériel archéologique.2. MatérielsLes tests immunologiques ont été réalisés sur une partie des échantillons de la collection du Laboratoire de Paléoparasitologie de Reims (UMR 5197). Au total, quatre-vingt-dix-neuf échantillons de coprolithes et de sédiments riches en matière organique d’origine fécale ont été étudiés, qui se répartissent de la manière suivante.AllemagneLes échantillons allemands testés proviennent tous de villages lacustres situés sur les rives du lac de Constance (Hornstaad-Hörnle I), ou sur le pourtour du Federsee (Stockwiesen, Torwiesen II, Taschenwiesen et Gründwiesen). Ils sont datés, par dendrochronologie, du Néolithique, entre 3 900 et 2 500 ans avant J.-C. Les échantillons ont été prélevés dans les couches d’habitat des différents sites (Diekmann, 1990 ; Kolb, 1997 ; Schlichtherle et Hohl, 2002).SuisseLes échantillons de Suisse proviennent de deux sites très différents. Le premier, Arbon-Bleiche 3, est une ancienne cité lacustre néolithique (environ 3 400 ans avant J.-C.) située sur les bords du lac de Constance (Leuzinger, 2000 ; Jacomet et al., 2005). Les prélèvements étudiés sont des échantillons de coprolithes et leurs sédiments sous-jacents.Le second site, Chevenez, est daté des VIIe-IXe siècles après J.-C. Les cinq échantillons ont été prélevés sur des squelettes, au niveau de la cavité abdominale et du sacrum.FranceLes prélèvements de Chalain sont des échantillons de coprolithes, associés à leurs sédiments sous-jacents, retrouvés dans la cité lacustre jurassienne (Chalain 3 et Chalain 19). Ils proviennent de couches d’habitat datées entre 3 200 et 3 100 ans avant J.-C. (Pétrequin et Pétrequin, 1988).Les échantillons du site de Lattes (Hérault) sont issus d’un puits situé dans la cour intérieure d’une grande maison d’époque préromaine (Ier-IIe siècle après J.-C.). Les couches échantillonnées contenaient, parmi d’autres artéfacts archéologiques, un squelette humain (Piqués et Buxó, 2005).Le site de Pineuilh est situé près de la commune de Sainte-Foy-la-Grande, en Gironde. Il est daté de la fin du Xe siècle, début du XIe siècle de notre ère. Neuf échantillons issus des couches sédimentaires du site ont été analysés.Les échantillons d’Épinal proviennent des fouilles du Palais de Justice de 1999. Le matériel, de nature sédimentaire, a été prélevé dans les couches de comblement de plusieurs latrines datées entre les XIIIe et XVIIe siècles après J.-C.LituanieLes échantillons de Lituanie sont issus de la découverte des squelettes des Grognards de l’armée napoléonienne, retrouvés à Vilnius. Les échantillons ont été prélevés au niveau des corps. Ils sont datés du XIXe siècle de notre ère (Signoli et al., 2004).GrèceLes échantillons de Grèce proviennent du site de Kouphovouno, daté entre 5 000 et 2 000 ans avant J.-C. Les prélèvements ont été effectués sur une série de squelettes retrouvés sur le site (Renard, 1997).ÉgypteLes échantillons du site d’Alexandrie ont été prélevés dans un carottage réalisé dans le port antique. Ils sont datés par radiocarbone entre le IIIe et le VIIe siècle après J.-C. (Goiran et al., 2000).Les deux échantillons de Saqqarah sont des sédiments issus d’une jarre à rejet d’embaumement datée de la XXVe dynastie (715 à 656 ans avant J.-C.) (Ziegler, 1997).NubieLes échantillons nubiens ont été prélevés sur des squelettes et des momies naturelles d’une des nécropoles de l’ile de Saï. Ils sont datés de la période méroïtique (275 BC à 300 AD) (Geus, 1995).ChypreLe matériel chypriote provient des fouilles de Shillourokambos. Les trois échantillons ont été prélevés en contexte sépulcral. Ils sont datés de la période précéramique, entre 7 500 et 7 000 ans avant J.-C. (Guilaine et Le Brun, 2003).IsraëlLes deux échantillons israéliens sont issus du site du Qumram, et proviennent de petites fosses reconnues comme étant des latrines (Harter et al., 2004). L’occupation du site est évaluée autour du Ier siècle avant J.-C. (De Vaux, 1961).États-UnisLe matériel américain provient d’un cimetière (Meadowlark cemetery) situé près de la ville de Manhattan, au Kansas (Pye et al., 2004). Les cinq échantillons, datés du XIXe siècle, ont été prélevés sur des squelettes, au niveau de la cavité abdominale.Le tableau 1 détaille la liste des échantillons traités, leurs natures et leurs datations.Tableau 1 : Sites archéologiques provenant de la collection de Reims, étudiés en immunologieTable 1: Archaeological sites from the collection of Reims, studied with immunological techniques.3. MéthodesParmi les techniques immunologiques disponibles et applicables à nos échantillons, c’est la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) qui a été retenue pour tester la présence d’unicellulaires parasites dans les échantillons archéologiques. Le kit « Entamoeba histolytica II® », fabriqué par les laboratoires TechLab® aux États-Unis, a été utilisé. Il permet la détection des coproantigènes de l’amibe pathogène grâce à la mise en jeu d’anticorps monoclonaux spécifiques du parasite chez l’homme (Haque et al., 1995 ; 1998 ; 2000 ; Mirelman et al., 1997).Avant de pouvoir tester les échantillons archéologiques bruts et souvent secs, il a fallu les réhydrater. La technique de réhydratation classique du laboratoire de Reims n’a pas été utilisée. Celle-ci emploie une solution de phosphate trisodique et de glycérol, à laquelle sont ajoutées quelques gouttes de formol qui préviennent le développement de champignons ou de bactéries (Le Bailly et al., 2003). Bien que les concentrations en formol soient faibles, il est toujours contestable d’employer le formaldéhyde dont un des effets est de former des ponts méthylènes ou « ponts formol » entre les protéines (Hould, 1984 ; Exbrayat, 2000), rendant la fixation des anticorps problématique. De plus, la notice d’utilisation des kits ELISA spécifie de ne pas employer d’échantillons formolés depuis plus de 48 heures. Finalement, pour éviter toute modification des réactions de liaison anticorps/antigènes, la réhydratation du matériel archéologique s’est faite uniquement avec de l’eau ultrapure (Millipore®). Les échantillons réhydratés à l’eau ont été conservés dans un réfrigérateur à 4 °C pour éviter la prolifération de microorganismes gênants (algues, micromycètes).Les échantillons archéologiques ainsi préparés ont été soumis aux tests ELISA. Les protocoles spécifiés dans les kits ont été appliqués sans aucune modification (Le Bailly, 2005). Les tests ELISA se font à l’aide de plaques creusées de 96 puits. Pour chaque test, deux puits ont été utilisés pour les contrôles positif et négatif (témoins), afin de vérifier la bonne réalisation du protocole. Les autres puits ont servi pour les échantillons archéologiques.4. RésultatsParmi les 99 échantillons testés, 17 se sont révélés positifs pour Entamoeba histolytica. Les échantillons positifs aux antigènes d’E. histolytica ont été testés trois fois avec le même test « Entamoeba histolytica II® » de Techlab®, et ont donné les mêmes résultats. Le tableau 2 présente le détail des résultats.5. DiscussionLes données recueillies lors de ce travail concernent essentiellement l’Europe, et dans une moindre proportion, la Méditerranée orientale et l’Amérique du nord pour la période récente. Elles permettent de compléter les premières données sur la répartition chronogéographique d’Entamoeba histolytica (Gonçalves et al., 2004).Sur les quatre-vingt-dix-neuf testés au total, dix-sept échantillons se sont révélés positifs. Le détail apparaît dans le tableau 2. La proportion moyennement importante d’échantillons positifs semble témoigner d’une bonne conservation du signal antigénique recherché qui, dans le cas d’E. histolytica, est une adhésine membranaire présente à la surface des kystes du Protozoa. Des échantillons se sont révélés positifs sur le site grec de Kouphovouno, daté de la période de transition entre le Néolithique et l’Âge du bronze (5000-2000 BC). La présence du signal, depuis au moins 2 000 ans av. J.-C., semble indiquer que celui-ci ne s’est pas modifié au cours du temps, ou que ces modifications, souvent d’ordre génétique, n’ont pas été suffisantes pour en changer la nature ou la configuration.Tableau 2 : Liste des échantillons étudiés à Reims par la technique ELISA pour la détection d’Entamoeba histolytica.Table 2: List of the samples studied in Reims with ELISA method for the detection of Entamoeba histolytica.La compilation de ces informations donne un premier aperçu de l’évolution de l’amibiase au cours du temps. Ainsi la présence de cette parasitose sur le pourtour méditerranéen au Néolithique/Protohistoire contraste avec l’absence de celle-ci en Europe de l’ouest pour des périodes proches (Néolithique moyen et final), et pourrait être la conséquence d’un transport d’origine migratoire. De telles constatations ont déjà été faites pour d’autres parasitoses comme l’ascaridiose (Loreille et Bouchet, 2003 ; Harter, 2003) ou les schistosomiases (Bouchet et Paicheler, 1995 ; Bouchet et al., 2002 ; Harter, 2003).Positivité des échantillonsLe kit « Entamoeba histolytica II® » commercialisé par TechLab® est le seul kit immunologique reconnu pour la détection spécifique in vitro de l’amibe pathogène E. histolytica (Haque et al., 1998 ; Roy et al. 2005). L’antigène recherché est spécifique d’E. histolytica. Il s’agit de l’adhésine membranaire Gal/Gal NAc lectine. Contrairement à d’autres kits immunologiques commerciaux, le kit de TechLab® est le seul à permettre la distinction entre l’amibe pathogène E. histolytica, et les espèces non pathogènes comme E. dispar ou E. moshkovskii (Mirelman et al., 1997 ; Roy et al., 2005). Les possibles réactions croisées avec d’autres organismes pathogènes, comme Giardia lamblia ou Entamoeba coli, ont été écartées par le fabricant (Furrows et al., 2004). Cependant, il n’existe aucune donnée bibliographique concernant d’éventuelles réactions croisées avec les antigènes d’amibes libres de l’environnement telles Naegleriasp., Acanthamoebasp…Enfin, il est intéressant de mettre les résultats positifs en rapport avec la nature des échantillons. En effet, si au début des tests, aucune sélection d’échantillons n’a été réalisée, celle-ci s’est faite automatiquement, grâce à la spécificité importante du test employé envers un parasite humain. Les échantillons positifs sont dans 88 % des cas, des matériels prélevés directement sur des squelettes (Chevenez, Kouphovouno et Meadowlark cemetery), ou dans des couches associées à des restes humains (Lattes) (Tableau 1). La probabilité d’être en présence de faux-positifs dans les résultats des tests immunologiques est donc encore diminuée.Négativité des échantillonsLa négativité des échantillons soulève également de nombreuses questions :La première concernant la sensibilité des outils employés face à ce matériel particulier. D’infimes concentrations en antigènes peuvent être détectées par le kit E. histolytica II. En revanche, la présence d’une trop grande quantité d’inhibiteurs dans les échantillons peut limiter la formation des complexes anticorps/antigènes.De même, les traitements funéraires appliqués aux cadavres ou aux sépultures pourront être la cause de l’absence ou la perte d’un signal.Les conditions paléoenvironnementales de chaque site étudié doivent être prises en compte afin de vérifier la compatibilité des résultats épidémiologiques et des contraintes climatiques et écologiques nécessaires à la dissémination du parasite.Enfin, l’émission des kystes d’amibe étant irrégulière, l’absence d’antigène pourrait être simplement le reflet d’une période de non dissémination.De telles interrogations trouveront peut-être des éléments de réponse au fur et à mesure des recherches et des collaborations interdisciplinaires.6. ConclusionsLa Paléoparasitologie débute les travaux en immunologie. Les résultats de cette étude, s’ajoutent à ceux de travaux antérieurs réalisés pour détecter des unicellulaires sanguins, Plasmodium falciparum (Miller et al., 1994 ; Cerruti et al., 1999), Trypanosoma cruzi (Fornaciari et al., 1992) et des helminthes, Schistosomasp. (Deelder et al., 1990 ; Miller et al., 1992). Ils prouvent la possibilité d’utiliser l’outil immunologique sur le matériel archéologique, et mettent en exergue le caractère incontournable de ces techniques de pointe.La mise en jeu dans les kits immunologiques d’anticorps monoclonaux spécifiques, pour la détection des antigènes de parasites humains, permet une identification plus précise des pathogènes mis en évidence. Ainsi il devient possible de caractériser les parasites au niveau spécifique, détermination rarement possible avec la seule observation microscopique des œufs d’helminthes (Bouchet et al., 1989 ; Le Bailly et al., 2003). Cette limite de la Paléoparasitologie n’est donc pas insurmontable.Dans le futur, l’immunologie, mais aussi la biologie moléculaire, tiendront une place de plus en plus importante dans les études paléopathologiques, à la fois pour diversifier les parasitoses recherchées en contexte archéologique, mais également pour affiner le diagnostic paléoparasitologique. Les résultats de cette étude doivent ouvrir la porte à d’autres analyses, mais aussi d’autres méthodes de détection des unicellulaires, telles la PCR multiple en temps réel (Blessmann et al., 2002 ; Verweij et al., 2004), ou la PCR SHELA, qui combine la technique PCR à l’immunodétection (Britten et al., 1997 ; Furrows et al., 2004).L’étude réalisée à Reims est la première de cette envergure en Europe. Elle s’ajoute au travail initié lors d’une collaboration franco-brésilienne (programme COFECUB) (Gonçalves et al., 2002 ; 2004), et complète en partie les données sur la répartition des protozoaires dans le monde. Si quelques hypothèses semblent germer concernant l’importance des migrations humaines dans le transport des parasitoses, les résultats restent pour le moment trop peu nombreux et doivent se multiplier pour être approfondis.Allison, M. J., Bergman, T. et Gerszten, E., 1999. Further Studies on Parasites in Antiquity, American Journal of Clinical Pathology, 112 (5), p. 605-609.Blessmann, J., Buss, H., Ton Nu, P. A., Dinh, B. T., Viet Ngo, Q. T., Le Van, A., Abd Alla, M. D., Jackson, T. F. H. G., Ravdin, J. I. et Tannich E., 2002. Real-Time PCR for Detection and Differenciation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in Fecal Samples, Journal of Clinical Microbiology, 40 (12), p. 4413-4417.Bouchet, F., Audoin, F., Leger, N., Marchais, R., Baucheron, F. et Munoz La Casta, J., 1989. 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