Cromatografía líquida de alta eficacia
# Cromatografía líquida de alta eficacia

La cromatografía líquida de alta eficacia o high performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También es denominada cromatografía líquida de alta presión o cromatografía líquida de alta resolución (high pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso. La HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. Se puede emplear para separar refinar sustancias químicas, o, lo que es más frecuente, para análisis químico.

## Proceso

En la HPLC isocrática, el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que avanzan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto para ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa y característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce así su difusión dentro de la columna, mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.

Una mejora introducida en la técnica de HPLC descrita fue la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua, mientras que los compuestos más hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos. La elución en gradiente a menudo se realiza empleando una bomba programable con distintos canales de entrada, la cual mezcla los distintos componentes de la fase móvil durante la cromatografía.

## Tipos de HPLC

### Cromatografía de fase normal

La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos sobre la base de su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.

La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés, sino también en factores estéricos, de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.

La NP-HPLC cayó en desuso en los años 1970 con el desarrollo de la HPLC de fase reversa o reversed-phase HPLC. En la NP-HPLC existía poca reproducibilidad de los tiempos de retención, puesto que los disolventes próticos cambiaban el estado de hidratación de la silica o alúmina de la cromatografía.

### Cromatografía de fase inversa (o reversa)

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la sílice tratada con $RMe_2SiCl,$ donde la R es una cadena de alcano tal como $C_{18}H_{37}$ o $C_8H_{17}.$ El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.

El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada, que a menudo se la denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por el aumento de la entropía, y la consecuente disminución de la energía libre, asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición, de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.

Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la retención. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Aun así, las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria, ya que no pueden entrar en los poros más pequeños de la fase estacionaria. El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmóvil, otras modificaciones de la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial, y como la entropía de la interfase compuesto-disolvente está controlada precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención.

Otra variable importante es el pH, puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación cromatográfica.

Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun así, muchas columnas de fase reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso, puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de HPLC.

### Cromatografía de exclusión molecular

La cromatografía de exclusión molecular, también conocida como cromatografía por filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución, de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil para la determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas.

La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan según su peso molecular, o más precisamente, según su radio de Stokes.

En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prácticos, la columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta. Por tanto, las moléculas de mayor tamaño salen en primer lugar de la columna, al quedarse menos retenidas en los poros, mientras que las mas pequeñas saldrán en último lugar.

### Cromatografía de intercambio iónico

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. En general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones con elevada carga y radio pequeño. Un incremento en la concentración del contraión (respecto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retención. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio catiónico mientras que una disminución del pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio aniónico. Este tipo de cromatografía es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones: purificación de agua, concentración de componentes traza, cromatografía de proteínas por afinidad a metales inmovilizados (IMAC), cromatografía de proteínas por intercambio iónico, cromatografía de carbohidratos y oligosacáridos por intercambio de aniones a elevado pH, etc.

### Cromatografía basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos complejos involucra la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria.

### Cromatografía líquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes (DHPLC)

Se trata de un método que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya casi totalmente en desuso debido al auge de la secuenciación), que permite detectar la presencia de variaciones en el ADN aunque no se determinan específicamente cuáles. En este caso, se utiliza la técnica cromatográfica para la detección de heterodúplex de ADN, en lugar de utilizar un gel para correr las moléculas de ácidos nucleicos.

El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentando la temperatura normalmente) una muestra que contenga tanto el ADN problema como un ADN control, que no es más que el mismo ADN problema pero en su versión silvestre o normal (sin mutaciones). Luego se procede a renaturalizar (disminuyendo la temperatura), de manera que aquellas cadenas de ADN que vuelvan a unirse con sus respectivas complementarias (cadena "a" silvestre con cadena "b" silvestre; o bien cadena "a" mutante con cadena "b" mutante) no presentarán diferencia con el estado original; sin embargo, si por ejemplo una cadena "a" silvestre híbrida con una cadena "b" mutante, aquella región (más o menos amplia) en la que exista mutación no complementará, formándose un bucle u horquilla, es decir, una región en la que las bases nitrogenadas no son complementarias y no establecen las uniones características por puentes de hidrógeno en la doble hélice de ADN. Dichas estructuras son los denominados heterodúplex (dúplex de ADN híbridos). Estos heterodúplex migran de forma diferente a los homodúplex en la columna de cromatografía de fase reversa (al igual que lo hacen en un gel de agarosa o acrilamida). La separación se realiza en condiciones desnaturalizantes variables, detectándose las moléculas de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm. Esto origina un pico de elución a un tiempo característico. A medida que se incrementan las condiciones desnaturalizantes los heterodúplex migran por delante de los homodúplex, apareciendo los picos correspondientes a heterodúplex antes en el gráfico resultante, el cromatograma. De esta manera, como los heterodúplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los homodúplex, ambas moléculas dan lugar a picos de elución distintos.

Previo al proceso inicial de desnaturalización se suele llevar a cabo una PCR para la amplificación del ADN molde en fragmentos de unas 150-450 pb.

Con este sistema pueden detectarse fácilmente sustituciones de una base, inserciones o deleciones, con un coste reducido y de manera rápida (aproximadamente 16 minutos).

### Cromatografía enantiomérica

La cromatografía enantiomérica permite separar un tipo concreto de estereoisómeros que son especialmente difíciles de segregar, los enantiómeros. Los enantiómeros, también llamados isómeros ópticos, se caracterizan por ser entre sí imágenes especulares no superponibles, de igual forma que lo son la mano izquierda con respecto a la derecha. Estos compuestos comparten las mismas propiedades físicas, por lo que no se ven afectados por la mayoría de métodos de separación, incluidas las técnicas cromatográficas tradicionales. Sin embargo, los enantiómeros pueden tener efectos biológicos muy diferentes, tal y como ocurrió con la crisis sanitaria causada por el fármaco talidomida.

La cromatografía enantiomérica emplea fases estacionarias quirales, de modo que su estructura "encaja" mejor con uno de los enantiómeros. Por tanto, el tiempo de retención de uno de ellos es superior, lo que permite separar una mezcla racémica en dos compuestos enantiómeros puros.

## Parámetros

### Platos teóricos

El número de platos teóricos es el parámetro fundamental que determina el poder de separación de una columna cromatográfica. La teoría de los platos teóricos se creó para la destilación continua, pero también se puede emplear en múltiples técnicas de separación, incluyendo la cromatografía. En una torre de destilación, se colocan platos o bandejas a diferentes alturas para condensar los diferentes componentes de la mezcla, de manera que en cada uno de ellos se establece un equilibrio vapor-líquido. Por tanto, al aumentar el número de platos, se mejora la separación.

En 1941, A.J. Porter Martin y Richard L. M. Synge adaptaron la teoría de platos teóricos a la cromatografía. El número de platos teóricos aumenta con la longitud de la columna, pero también depende de muchos otros factores, como el tamaño de partícula de la fase sólida (a menor tamaño mayor número de platos), la composición de la fase estacionaria, y las condiciones de la separación (fase móvil, caudal, presión, temperatura, etc)

### Diámetro interno

El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. A mayor diámetro, mayor es el flujo que admite la columna sin aumentar la presión, pero también aumenta la difusión molecular en su interior, lo que disminuye la resolución de la técnica, e incrementa los límites de detección y cuantificación de la técnica. Las columnas de diámetro interno más grande (>10mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos para su utilización posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analítico. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometría de masas.

### Medida de las partículas

La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5 µm de diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad, aumentaría la resolución de la columna, pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho.

### Tamaño del poro

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeños proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cinética mejor, especialmente para los compuestos de tamaño más grande; por ejemplo, una proteína que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros puede entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.

### Presión del sistema

La presión de las bombas es variable según el modelo y fabricante, pero su rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presión puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmósferas). Los aparatos más modernos de HPLC incorporan mejoras para poder trabajar a presiones más altas y, por lo tanto, poder utilizar partículas de tamaño más pequeño en las columnas (< 2 micrómetros). Estos nuevos aparatos, denominados ultra performance liquid chromatography (UPLC) pueden trabajar con valores de hasta 100 MPa de presión (unas 1000 atmósferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas UPLC son una marca registrada de Waters Corporation aunque a

veces se utilizan de forma general para designar este tipo de aparatos).

