Con il passaggio della Ventura alla Rai nel 2001 la nuova conduttrice è Alessia Marcuzzi, con Luca e Paolo. Dal gennaio 2016 va in onda con due puntate in prima serata, prima la domenica e il martedì, poi la domenica e il giovedì, condotte da Geppi Cucciari rispettivamente insieme a Fabio Volo e Miriam Leone nella puntata della domenica, e a Nadia Toffa e Pif nella puntata del martedì, successivamente spostata al giovedì. Il programma, dato il successo, sbarca anche in prima serata con il titolo "Le Iene Show", con la collaborazione prima di Claudio Bisio e poi di Enrico Bertolino. In questi anni il format si assesta nella prima serata della domenica in accoppiata con "Mai dire domenica", fino a sfociare in una fusione dei due format, intitolata "Mai dire Iene" e condotta dalla Gialappa's Band con il Mago Forest e Alessia Marcuzzi.