text: Hochschulschriften der UB Wuppertal / Identifizierung und funktionelle Charakterisierung phagosomaler Proteine aus Tetrahymena thermophila
  Identifizierung und funktionelle Charakterisierung phagosomaler Proteine aus Tetrahymena thermophila
  Wittich, Viktoria
  urn:nbn:de:hbz:468-20140805-093607-8
  Identifizierung und funktionelle Charakterisierung phagosomaler Proteine aus Tetrahymena thermophila [4.27 mb]
  Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese konnten aus zwei stadienspezifischen Proteinisolierungen aus dem Organismus T. thermophila 70 Proteinspots (30 sek) und 30 Proteinspots (5 min) nachgewiesen werden. Eine genauere Überprüfung dieser stadienspezifischen Proteine mit einer MudPIT-Analyse lieferte insgesamt 707 phagosomale Proteine. Nach einer Zuordnung der bekannten Proteine in die funktionellen Gruppen, konnten 335 Proteine als zumindest von der Funktion her bekannte Phagozytose-relevante Proteine bewertet werden. 140 Proteine waren charakteristisch ausschließlich für den Zeitpunkt 30 Sekunden nach Induktion der Phagozytose und 15 Proteine repräsentierten den Zeitpunkt 5 Minuten nach Induktion. 118 der insgesamt 372 hypothetischen Proteine des Phagosoms konnten entsprechende biologische Prozesse zugeordnet werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass über 38% der nachgewiesenen Proteine eine entscheidende Rolle im Phagozytoseprozess von Tetrahymena spielen könnten, deren Funktion an ausgewählten Proteinen, bzw. deren mRNAs, durch weitere Methoden überprüft werden sollte.
  Die Quantifizierung von ausgewählten Proteinen der MudPIT-Analysen mittels der quantitativen PCR (qPCR) erforderte zunächst die Etablierung eines geeigneten qPCR-Systems. Die Analysen bestätigten die Phagozytose-Relevanz in Form von erhöhter mRNA-Expression für die stadienspezifischen Proteine VPS 13 und SNARE, zeigten jedoch eine im Vergleich zur MudPIT-Analyse abweichende Stadien-Zuordnung. Die Resultate der qPCR-Analyse der beiden phagosomalen Proteine PHP 1 und PHP 2 wiesen keine Phagozytose-abhängige erhöhte mRNA-Expression auf. Diese Ergebnisse führten zu der Annahme, dass keine direkte Korrelation der qPCR- und MudPIT-Ergebnisse besteht. Eine Möglichkeit wäre, dass diese Proteine bereits in der Zelle in einem Vesikel verpackt vorliegen und erst bei initiierter Phagozytose zu den bestimmten Zellkompartimenten wie Phagosom transportiert werden. Eine andere Möglichkeit wäre, dass sie so schnell translatiert werden, dass sie zwar in der MudPIT-Analyse als Protein erscheinen, aber in der qPCR als mRNA nicht erhöht nachweisbar sind. Insgesamt zeigten die mRNA-qPCR-Ergebnisse bzgl. der Stadienspezifität und der Phagozytose-Relevanz eine umgekehrte Korrelation mit den Protein-MudPIT-Resultaten bei allen untersuchten Proteinen. Zusätzlich deuten die qPCR-Resultate darauf hin, dass diese Proteine nicht ausschließlich phagosomale Funktionen in der Zelle ausüben.
  Um die Lokalisation und zeitliche Abhängigkeit zu überprüfen, wurde das tagging mittels GFP etabliert. Ein entsprechendes GFP-Fusionsprotein-Konstrukt konnte hergestellt, in die Zellen injiziert und fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden.
  Als Zielproteine wurden die vier stadienspezifischen Proteine SNARE, 14-3-3, PHP 1 und PHP 2 mittels GFP-tagging ausgewählt. Die Phagosomen-Assoziation zum Zeitpunkt 30 Sekunden nach Induktion der Phagozytose konnte für alle untersuchten Proteine gezeigt werden. Zusätzlich konnten wie Phagosomen-Assoziation in weiteren Zeitstadien im Verlauf der Cyclose (30 Sekunden bis 120 Minuten) nachgewiesen werden. Auf dieser Grundlage wurde ein Modell entwickelt, welches die stadienspezifischen Funktionen der vier ausgewählten Proteine im Prozess Phagozytose darstellt. So konnte gezeigt werden, dass das SNARE-Protein für die Fusionsprozesse am Phagosom zu Beginn (30 Sekunden) und gegen Ende der Cyclose (120 Minuten) verantwortlich ist. Die Bereitstellung der Mikrotubuli, die den Transport des Phagosoms vom Cytostom zum Cytoproct gewährleisten, wird möglicherweise vom 14-3-3-Protein reguliert. Dem PHP 1-Protein wurde eine mögliche Funktion als Protein-Prozessierungs-Enzym bei der Bildung und Reifung des Phagosoms zugeschrieben. Weitere Reifungsprozesse könnten ebenso vom PHP 2-Protein reguliert werden. Die Ergebnisse der Untersuchung zu den Zeitpunkten 30 Sekunden bis 120 min ergaben zusätzlich, dass alle Proteine zu den untersuchten Zeitpunkten auch in anderen Bereichen der Zelle (Nukleus, ER, Cytoproct und Oralapparat) nachweisbar sind. Diese Proteine könnten möglicherweise in verschiedene Aspekte der Phagozytose involviert sein und/oder auch andere Phagozytose-unabhängige zelluläre Funktionen erfüllen.
  Mit dem GFP-Fusionsprotein-Nachweis konnten die Ergebnisse der MudPIT-Untersuchung sowie die umgekehrte Korrelation mit den qPCR-Resultaten weitestgehend bestätigt werden.