text: Neue acetylenische Oxylipine mit frahemmenden Eigenschaften gegen herbivore Schnecken aus dem Moos Dicranum scoparium.
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  DOI: 10.1002/ange.201000825
  Neue acetylenische Oxylipine mit fraßhemmenden Eigenschaften
  gegen herbivore Schnecken aus dem Moos Dicranum scoparium**
  Martin Rempt und Georg Pohnert*
  Professor Wilhelm Boland zum 60. Geburtstag gewidmet
  Beobachtungen zeigen, dass selbst in Regionen, in denen
  Herbivore intensiv hhere Pflanzen befallen, Moose selten
  gefressen werden. Die ersten Untersuchungen von Ernst
  Stahl ber die chemische Verteidigung von Pflanzen und
  Moosen gegen Schnecken liegen nun mehr als 100 Jahre
  zurck,[1] dennoch wissen wir auch heute noch wenig ber die
  Beschaffenheit und Biosynthesen der beteiligten Verteidigungsmetaboliten in Moosen.[2, 3] Dicranum scoparium, das in
  dichten Polstern in Wldern der arktischen und gemßigten
  Klimazonen vorkommt, ist ein Beispiel fr ein gut verteidigtes Moos, das in der Natur wenige bis keine Fraßspuren aufweist. Unlngst zeigte ein Screening, dass D. scoparium durch
  die Oxidation von ungesttigten Fettsuren zahlreiche
  flchtige Oxylipine produziert.[4] Aus diesem Moos wurden
  außerdem ungewhnliche acetylenische Cyclopentenone
  isoliert, die wahrscheinlich auch ber Oxylipin-Stoffwechselwege aus der im Moos dominanten acetylenischen Fettsure Dicranin biosynthetisiert werden.[5]
  Motiviert durch die Beobachtung, dass in anderen Organismen Oxylipine oft direkt als Verteidigungsmetabolite
  fungieren oder an der Regulation von Verteidigungsreaktionen beteiligt sind,[6, 7] untersuchen wir die chemische kologie
  dieser Verbindungen aus D. scoparium. Analog zu hheren
  Pflanzen und Diatomeen wird auch in Moosen die Synthese
  von flchtigen Oxylipinen durch mechanische Verwundung
  ausgelst.[6, 8] Ein Vergleich der UPLC/MS-Profile (Ultra
  Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry)
  der Methanolextrakte von intaktem und verwundetem Moos
  zeigt, dass eine Verwundung in der massiven Produktion
  einer komplexen Mischung von nichtflchtigen Verbindungen resultiert (Abbildung 1). Da die Chromatogramme eine
  Vielzahl von Signalen lieferten, suchten wir nach Mglichkeiten, die Produkte einzelner Stoffwechselwege durch den
  Einsatz von markierten Biosynthesevorstufen zu identifizieren. Eine einfache Synthese mono- und dideuterierter Fettsuren ermglichte es, die notwendigen stabilisotop mar[*] M. Rempt, Prof. Dr. G. Pohnert
  Institut fr Anorganische und Analytische Chemie, Bioorganische
  Analytik, Friedrich-Schiller-Universitt
  Lessingstraße 8, 07743 Jena (Deutschland)
  Fax: (+ 49) 3641-948-172
  Homepage: http://www.uni-jena.de/Prof_Dr_Georg_Pohnert.html
  [**] Wir danken der DFG (PO628/5-1) und der Volkswagen-Stiftung fr
  finanzielle Untersttzung. Paulina Dabrowska danken wir fr die
  Untersttzung bei GC/MS-Untersuchungen.
  http://dx.doi.org/10.1002/ange.201000825 zu finden.
  Angew. Chem. 2010, 122, 4865 –4868
  kierten Vorstufen herzustellen (Schema 1). Diese wurden
  dann als wssrige Suspension zu feingemrsertem gefrorenen
  Moos appliziert. Nach 10 Minuten konnten die de novo gebildeten Oxylipine extrahiert werden. Dabei stellte sich
  heraus, dass die acetylenische Fettsure Dicranin als Vorstufe
  fr zahlreiche, zum Teil bis dahin unbekannte, Oxylipine von
  besonderem Interesse ist.
  Schema 1. Synthese mono- und dideuterierter Fettsuren. a) LDA, Abfangen mit MeOD; b) NaOMe/MeOD; c) KOH/H2O.
  Da nicht alle Oxylipine chromatographisch getrennt
  werden konnten, gestaltete sich die manuelle Identifizierung
  aller relevanten Signale der UPLC/MS-Analysen schwierig.
  Wir entwickelten deshalb eine automatisierte Analysenmethode, die die markierten Metaboliten erfasst. Zunchst
  wurden alle Masse-Retentionszeit-Paare durch automatische
  Peakerkennung aus den Chromatogrammen extrahiert. Diese
  Datenstze wurden fr nichtbehandelte Kontrollen und
  Umsetzungen in Gegenwart von einfach und doppelt deuterierten Fettsuren erhoben. Die weitere Auswertung beruhte
  auf einer CAP-Analyse (Canonical Analysis of Principal
  components),[9] die dann eine direkte Zuordnung von Dircanin abgeleiteter Signale ermglichte (Abbildung 1; siehe die
  Hintergrundinformationen fr Details). Im Vergleich zur
  etablierten manuellen Auswertung von Einbaumustern ermglicht diese automatisierte Methode eine schnellere und
  vollstndigere Analyse der Produkte spezifischer Stoffwechselwege. Somit kann der gesamte Polarittsbereich abgedeckt
  werden, der in der LC/MS erfasst wird. Es werden auch
  Spurenkomponenten und chromatographisch nicht getrennte
  Metaboliten erkannt.
  Der Einsatz zweier Vorstufen mit unterschiedlichem
  Markierungsgrad in unabhngigen Experimenten untersttzt
  die automatisierte Datenauswertung, ist aber nicht unbedingt
  Abbildung 1. Suche nach von Dicranin abgeleiteten Metaboliten: a) Masse-Retentionszeit-Paare werden mit einer automatischen Routine aus
  UPLC/MS-Chromatogrammen (z. B. Kontrolle, nach Zugabe von [2H1]- oder [2H2]-markierten Fettsuren) extrahiert. Irel. = relative Intensitt im
  Vergleich zum hchsten Signal. b) Die Daten aller Replikate werden mit CAP evaluiert und in einem Diagramm mit kanonischen Achsen (CA)
  aufgetragen. Drei gut getrennte Gruppen, die fr die unterschiedlich markierten Produkte stehen, sind erkennbar. c) Auftragung der auf die Gesamtintensitt normierten Intensitt Inorm. eines Markersignals (hier 2 amu hher als das [M H] -Signal der unmarkierten Verbindung).
  erforderlich. In unserem Fall wurden die Daten aus der
  Umsetzung der zweiten markierten Vorstufe als unabhngige
  Kontrolle genutzt, und nur Verbindungen, die je nach applizierter Vorstufe einfach oder doppelt deuteriert nachgewiesen werden konnten, wurden weiterverfolgt (Abbildung 1 c).
  Wird nur eine markierte Vorstufe eingesetzt, empfiehlt sich
  eine manuelle berprfung der identifizierten Signale, um
  falsch-positive Zuordnungen zu vermeiden. Anhand der
  durch CAP identifizierten Masse-Retentionszeit-Paare
  konnten die von Dicranin abgeleiteten Verbindungen mithilfe
  von prparativer HPLC aufgereinigt werden. Die Strukturaufklrung der Verbindungen 2–6 und 8 sttzt sich auf einund zweidimensionale NMR-Experimente sowie auf MS-,
  UV- und IR-Daten. Der Strukturvorschlag fr 7 wurde
  anhand von GC/MS-Daten einer derivatisierten Probe dieser
  Verbindung erarbeitet. Die absoluten Konfigurationen der
  optisch aktiven Verbindungen wurden nach der Mosher-Methode oder durch Vergleich von gemessenen und berechneten
  CD-Spektren zugeordnet. (Ausfhrliche Beschreibungen der
  Strukturaufklrungen, spektroskopische Daten und Spektren
  finden sich in den Hintergrundinformationen.) Nach dem
  oben beschriebenen Schema konnten sieben neue, von Dicranin abgeleitete Verbindungen charakterisiert werden
  Auch die literaturbekannten antimikrobiellen Cyclopentenone Dicranenon A (1) und B1 wurden mit der CAP/NMRRoutine identifiziert.[5] Diese chiralen Dicranenone wurden
  nach Applikation von markierten Vorstufen mit einem hohen
  Deuterierungsgrad (bis 80 %) nachgewiesen. Dies zeigt, dass
  alle Enzyme der Cyclopentenon-Biosynthesen nach Verwundung von D. scoparium aktiv sind. Wir konnten auch das
  markierte Monoacylglycerin 2 nachweisen, das vermutlich
  durch lipasekatalysierte Veresterung von de novo synthetisiertem Dicranenon A (1) mit Glycerin entsteht. Neben den
  Cyclopentenonen konnten auch die hoch funktionalisierten
  offenkettigen C18-Oxylipine 3 und 4 nachgewiesen werden.
  Das (E)-5-Hydroperoxy-1-hydroxypent-3-en-2-on-Strukturmotiv von 3 kommt selten in Naturstoffen vor und ist bisher
  nur aus einem von Linolensure abgeleiteten Metaboliten aus
  Flachssamen bekannt.[10] Die (E)-1,5-Dihydroxypent-3-en-2-
  Schema 2. Neue von Dicranin abgeleitete Naturstoffe aus dem Moos D. scoparium.
  on-Struktur von 4 wurde bisher nur fr einen Linolensuremetaboliten von Mais postuliert.[11] Sowohl 3 als auch 4 sind
  optisch aktiv, was zeigt, dass zumindest die ersten Schritte der
  Fettsuretransformation zu a-Ketolen und eventuell auch die
  weitere Oxidation enzymkatalysiert ablaufen (Schema 3).
  Schema 3. Biosynthese der Verbindungen 1–4. AOS = Allenoxid-Synthase.
  Nach demselben experimentellen Schema konnten nach
  Applikation von anderen deuterierten Fettsuren und CAP
  auch z. B. von Linolensure abgeleitete Produkte identifiziert
  werden (Schema 4). Die Charakterisierung der literaturbekannten Verbindungen erfolgte in diesem Fall mit GC/MS-
  Schema 4. Von Linolensure abgeleitete Verbindungen.
  Methoden nach Derivatisierung der Analyte. Der Vergleich
  der Retentionszeiten und Massenspektren mit synthetischen
  Verbindungen und isolierten bekannten Naturstoffen lieferte
  hier den Strukturbeweis (siehe die Hintergrundinformationen). 12-Oxophytodiensure (9) konnte im Moos gefunden
  werden, hingegen war das Pflanzenhormon Jasmonsure,
  dessen Biosynthese in hheren Pflanzen von 9 ausgeht, nicht
  nachweisbar.[7] In den Extrakten konnten wir auch die krzerkettigen Oxylipine 10–12 detektieren.
  Die De-novo-Produktion aller identifizierten Oxylipine
  1–12 kann mit Biosynthesewegen ausgehend von 9- oder 13Lipoxygenasen erklrt werden. Die zunchst erzeugten 9Angew. Chem. 2010, 122, 4865 –4868
  oder 13-Hydroperoxide knnen ber Allenoxid-Synthesewege weiter umgesetzt werden, und die intermediren Allenoxide knnen dann zu 1–4 und 9 cyclisiert oder hydrolysiert werden (Schema 3). Transformationen der Hydroperoxide durch Hydroperoxid-Lyasen oder Lipoxygenasen mit
  Hydroperoxid-Lyase-Aktivitt wrden die Biosynthesen von
  5–8 und 10–12 erklren.[12] Da die beobachteten C12- und C13Verbindungen von C18-Fettsuren abgeleitet sind, knnten als
  zustzliche Fragmente der Transformationen auch flchtige
  C5- und C6-Verbindungen freigesetzt werden. Dies ist in guter
  bereinstimmung mit der berichteten Freisetzung von 1Penten-3-on, (E)-2-Pentenal, Hexenol und Hexenal nach
  mechanischer Verwundung von D. scoparium.[4]
  Die aufgereinigten Verbindungen dienten als Standard fr
  die Quantifizierung der Oxylipinproduktion mit UPLC/MS.
  Oxylipine wurden nur in den grnen, blattartigen Phylloiden
  des Mooses gebildet, nicht aber in den verholzten Stmmen.
  D.-scoparium-Phylloide produzierten bis zu 4.5 mg des
  Hauptmetaboliten 1 pro Gramm Feuchtgewicht. Somit
  werden durch Verwundung große Mengen an zum Teil reaktiven Oxylipinen freigesetzt.
  Da Oxylipine in hheren Pflanzen oft als Verteidigungsmetabolite diskutiert werden, berprften wir auch die fraßhemmende Wirkung dieser Verbindungen aus dem Moos.[6, 8]
  Wir testeten das nichtfraktionierte Oxylipinextrakt und
  reines Dicranenon A (1) gegen die herbivore Nacktschnecke
  Arion lusitanicus Mabille. Das Fraßverhalten dieser Schnecke, die in gemßigten Klimazonen weit verbreitet ist,[13]
  wurde einem Standardprotokoll fr Bioassays folgend untersucht.[14] Die Testsubstanzen wurden dazu in Methanol
  gelst und auf frische Eisbergsalat-Bltter gesprht. Mit
  Methanol besprhte Salatbltter dienten als Kontrolle. Die
  Fraßaktivitt der Nacktschnecken konnte dann durch Auswiegen der Salatbltter nach Versuchsende bestimmt werden
  (siehe die Hintergrundinformationen fr Details). Wurden
  die Salatbltter mit dem nichtfraktionierten Oxylipinextrakt
  behandelt (appliziert in 10facher Verdnnung, verglichen zu
  der im verwundeten Moos vorliegenden Konzentration),
  wurde die Fraßaktivitt der Schnecken stark herabgesetzt.
  Sogar in 1000facher Verdnnung war das Extrakt noch signifikant aktiv (Abbildung 2). Bei der Bewertung dieser Ergebnisse muss in Betracht gezogen werden, dass der Beitrag
  der Oxylipine zur chemischen Verteidigung sogar noch unterbestimmt wurde, da einige der identifizierten reaktiven
  Verbindungen unter den Versuchsbedingungen nicht stabil
  sind. Selbst wenn aus dem komplexen Gemisch an Oxylipinen
  nur die einzelne Verbindung Dicranenon A (1) als Reinsubstanz getestet wurde, konnte noch in 10facher Verdnnung
  verglichen zur Konzentration im verwundeten Moos eine signifikante Reduktion der Nahrungsaufnahme der Nacktschnecken beobachtet werden. Die Aktivitt des Rohextrakts
  und der reinen Verbindung belegt einen signifikanten Beitrag
  von Oxylipinen zur chemischen Verteidigung des Mooses.
  Wir haben hier mit einer neuen Methode zur Untersuchung von Biosynthesen gezeigt, dass D. scoparium nach
  Verwundung eine komplexe Mischung an zum Teil hochreaktiven Oxylipinen freisetzt, die stark zur chemischen Verteidigung dieses Mooses beitrgt. Da zahlreiche Moose nach
  Verwundung Oxylipine produzieren[4] kann vermutet werden,
  Bioassays und die spektroskopischen Daten enthlt, findet sich in den
  Hintergrundinformationen. Dort sind auch die fr die Strukturaufklrung wichtigen Spektren wiedergegeben.
  Eingegangen am 10. Februar 2010,
  vernderte Fassung am 24. Mrz 2010
  Online verffentlicht am 8. Juni 2010
  Stichwrter: Biosynthese · Bryophyten ·
  Chemische Verteidigung · Massenspektrometrie · Moose
  Abbildung 2. Fraßversuche mit dem Oxylipin-reichen Rohextrakt (A–D)
  und aufgereinigtem Dicranenon A (1; E–G) aus D. scoparium. Weiße
  Balken zeigen die Fraßaktivitt auf mit Rohextrakt behandeltem Salat
  und graue Balken die Aktivitt auf mit 1 behandeltem Futter. Die
  schwarzen Balken reprsentieren die Ergebnisse der Lsungsmittelkontrolle (Methanol). Das Rohextrakt wurde im Vergleich zur natrlichen
  Konzentration in (A) 1:10 verdnnt, in (B) 1:100 verdnnt, in (C)
  1:1000 verdnnt und in (D) 1:10000 verdnnt appliziert. (E) enthielt 1
  in natrlicher Konzentration, (F) 1:10 verdnnt, (G) 1:100 verdnnt.
  Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an (n = 15). *** p < 0.005,
  ** p = 0.010, n.s. = nicht signifikant im t-test.
  dass derartige Verbindungen generell an der chemischen
  Verteidigung der Moose mitwirken.
  Eine ausfhrliche Beschreibung der Experimente, die die Extraktion,
  die chemoinformatische Datenverarbeitung, die Strukturaufklrung,
  [1] E. Stahl, Jena. Z. Naturwiss. 1888, 22, 557.
  [2] W. P. Haines, J. A. A. Renwick, Entomol. Exp. Appl. 2009, 133,
  [3] J. D. Parker, D. E. Burkepile, D. O. Collins, J. Kubanek, M. E.
  Hay, Oikos 2007, 116, 302.
  [4] E. Croisier, M. Rempt, G. Pohnert, Phytochemistry 2010, 71, 574.
  [5] T. Ichikawa, M. Namikawa, K. Yamada, K. Sakai, K. Kondo,
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  [6] K. Matsui, Curr. Opin. Plant Biol. 2006, 9, 274.
  [7] E. Ble, Prog. Lipid Res. 1998, 37, 33.
  [8] G. Pohnert, Angew. Chem. 2000, 112, 4506; Angew. Chem. Int.
  Ed. 2000, 39, 4352.
  [9] M. J. Anderson, T. J. Willis, Ecology 2003, 84, 511.
  [10] A. N. Grechkin, R. A. Kuramshin, S. K. Latypov, Y. Y. Safonova,
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