text: Das Missverhältnis sollte in der Grundierung zentriert und flankiert von mindestens 8 Nukleotiden auf jeder Seite
  Die Primer müssen nicht phosphoryliert werden, noch müssen sie FPLC oder PAGE gereinigt, lediglich entsalzt sie sein sollten.
  Für die Berechnung der Tm Sie brauchen keine Formel, sondern Tm auf den Versand-Zertifikat sollte höher sein als 60 ° C.
  Für Screening-Zwecke ist es praktisch, einfügen oder löschen Restriktionsstelle mit Ihrem Mutation. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes gibt es viele Möglichkeiten, um eine Restriktionsschnittstelle mit Ihrem gewünschten Mutation einfügen. Die Website des New England Biolabs bietet ein Werkzeug, um eine solche geeignete Restriktionsschnittstelle zu finden. Geben Sie einfach Ihre Primer-Sequenz kodierend für die Aminosäuresequenz Sie es wünschen, mit der Mehrdeutigkeit Code für DNA. Das Enzym-Finder-Tool wird Ihnen sagen, welche Restriktionsstellen parallel zu Ihrem gewünschten Mutation eingeführt werden. Wenn Sie nicht finden können, eine mögliche oder praktische Restriktionsstelle durch diese Weise können Sie neue Restriktionsschnittstelle ohne Bezug auf den genetischen Code an der Stelle der Mutation einfügen. Danach können Sie mit diesem Plasmid als Template für eine Reihe von Mutationen in dem dieser Restriktionsstelle durch Einfügung des neuen mutagene Primer gelöscht werden. Dieser Ansatz kann sehr praktisch, wenn Sie planen, eine Reihe von Mutationen an der gleichen Stelle des Plasmids zu tun haben.
  DNA-Polymerase: Für dieses Verfahren benötigen Sie eine thermostabile DNA-Polymerase, die 3'-5 'Exonuklease-Aktivität aufweist und schafft stumpfen Enden. Wir verwenden immer rekombinante Pfu-Polymerase von Fermentas. Wenn Sie Probleme mit der Verstärkung Schritte haben Sie vielleicht versuchen, eine höhere Qualität Polymerase, aber für die meisten Zwecke der Standard Pfu genug sein. Vervollständigen Sie die Reaktion mit dNTPs, Polymerase-Puffer und Wasser.
  Die Thermocycler sollte in folgender Weise eingestellt werden. Die erste und wiederkehrende Denaturierung Phase ist es, 30sec bei 95 ° C eingestellt
  Die Annealingtemperatur der Primer darf nicht mit komplizierten Formeln berechnet werden. Wir in der Regel legen Sie die Annealingtemperatur auf 55 ° C und die Glühzeit zu einer Minute. Für Primer 25 bis 30 Nukleotiden, die Sie verwenden werden meistens funktioniert dies für uns 95% der Zeit. Jedenfalls, wenn dies nicht funktionieren sollte, versuchen Sie einfach die Variation der Annealing-Temperatur zwischen 50 - und 60 ° C.
  Die Dehnung ist abhängig von der Polymerase die Sie benutzen. In dieser Demonstration verwenden wir die Pfu-Polymerase von Fermentas, die für eine Dehnung Temperatur von 72 ° C nennt Die Dehnung der Zeit variiert je nach Größe des Plasmids. Wir sind immer zu berechnen 1 min pro kb, und fügen Sie eine zusätzliche Minute an, dassZeit. Zum Beispiel für eine 9kb Plasmid wir wählen würden 10min als Dehnung der Zeit.
  18 Zyklen ausreichend sind, um zu schaffen genug mutierte Plasmid für die weitere Verwendung. Keeping die Anzahl der Zyklen gering ist, spart auch Zeit.
  Die erfolgreiche Amplifikation sollte mittels einer Elektrophorese überprüft werden. Direkt nach dem Radfahren beendet ist, laden 5 ul der Reaktion auf ein 1% TAE-Agarosegel. Wenn die Verstärkung erfolgreich war, sollten Sie eine deutliche Bande. Allerdings, wenn das neu synthetisierte DNA ist nicht deutlich sichtbar auf dem Gel, können Sie versuchen, Niederschlag der ganzen Reaktion und verwenden es für die Transformation in den nächsten Schritt. Für uns hat nur selten gearbeitet, aber es lohnt sich zu versuchen. Das Beste, was zu tun ist, wenn die Reaktion nicht funktioniert ist die Glühtemperatur anzupassen.