Graamnegatiivsetel bakteritel on ainult üks peptidoglükaan-kiht. See-eest on neil kaks membraani - välis- ja sisemembraan, mille vahel on periplasmaatiline ruum. Periplasmaatiline ruum ei ole tühi. Seal asuvad mitmed ensüümid ja muud valgud (hüdrolüütilised ensüümid, retseptorid, transporti vahendavad valgud). Peptidoglükaan-kiht asub välis- ja sisemembraani vahel.