1940. aastal pärast Eesti inkorporeerimist Nõukogude Liidu koosseisu, toimusid suured muudatused ka EKÜ muuseumis. Muuseum riigistati ja selle baasil loodi Eesti NSV Riiklik Ajaloomuuseum. Osa varadest jaotati teistele muuseumidele. Loodusteaduslike kogude põhjal loodi iseseisev Eesti NSV Riiklik Loodusmuuseum. Sõjajärgseil aastail ruineeris muuseumi tugev ideoloogiline surve. Lisaks muuseumitöötajate represseerimisele viidi läbi nn "kahjulike" materjalide kõrvaldamine, mille käigus tuli hävitada kõik, mis meenutas omariikluse aega. Põhifondid, millest nii mõndagi hoiti alles tänu koguhoidjate isiklikule entusiasmile, on siiski suures osas säilinud.