Eesti Vabariigi (1918-1940) tähtsaimaks muuseumiks kujunes 1909. aastal rajatud Eesti Rahva Muuseum Tartus, kuid ka EKÜ muuseum säilitas oma väärtuslike  kollektsioonidega olulise positsiooni. Jõudsalt kasvasid arheoloogiakogu, loodusteaduslikud ja kultuuriloolised kollektsioonid ning arhiiv.