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  1454年伊莎贝拉的父亲卡斯提尔国王胡安二世死后,她的同父异母兄长恩里克四世继承王位。1469年她和堂弟亚拉冈王储费尔南多联姻。  1474年,恩里克四世去世,只有一个女儿胡安娜·拉·贝尔特兰尼哈,恩里克被指无法生育,而胡安娜是他亲信和王后的孩子。当时胡安娜已经嫁给了葡萄牙国王阿方索五世。伊莎贝拉迅速继承了王位。葡萄牙的阿方索五世发兵声称胡安娜应该继承王位,但1476年在托罗一役彻底失败。阿方索五世被迫签署阿尔卡索瓦什和约,放弃对卡斯提尔王位的一切要求。1478年伊莎贝拉在天主教教宗的批准下成立西班牙宗教裁判所,迫害非天主教人士并大力提升了王权。1479年费尔南多的父王去世,费尔南多二世和伊莎贝拉成为亚拉冈和卡斯提尔的国王、女王。1480年这对夫妇召集群臣和34位平民代表制定了一系列法律、为未来的西班牙奠定了法理基础。  伊莎贝拉任内时常召开名为「科提斯」的国家议会,并且将大部分的行政权托付给「卡斯蒂利亚会议」。卡斯蒂利亚会议的成员由王室任命,是推行专制政治的有力新工具。她与中产阶级联手对抗贵族阶级,并以城镇的民兵为其军事力量的后盾,她又将传统封建贵族的三大军团交由丈夫费尔南多掌管、压制,解除了贵族的军事威胁。她对于牧羊业老板所组的「马士达」公会则较为纵容,因为政府的税收主要来自牧羊业,这种情形一直持续到新大陆的财富大量输入西班牙之前。

  1492年1月2日,伊莎贝和费尔南多的军队攻下了统治伊比利亚半岛南部七个世纪的摩尔人的最后一个重镇格拉纳达,完成在伊比利亚半岛基督教势力对伊斯兰势力数个世纪的征战收复失地运动。  同年,在对克里斯托弗·哥伦布向西航海去印度的计划三次拒绝之后,伊莎贝终于同意资助哥伦布的探险。由于财政吃紧,伊莎贝拉拿出一个自己的装满首饰的首饰盒给哥伦布作为资助,同时答应哥伦布的条件:他和他的后代做为西班牙开拓的殖民地的总督,并获得一成的利润。8月3日哥伦布启航。次年携带着一些印第安人和黄金凯旋,西班牙从此进入了海外冒险和殖民的黄金时代。1494年,伊莎贝和费尔南多通过《托德西利亚斯条约》和葡萄牙瓜分了世界。伊莎贝曾经试图为了保护印第安人免受西班牙殖民者的虐待而组建了一个印第安事务处。但后来的西班牙征服者并没有遵守女王的规定,反而极力迫害印地安人。  1492年3月31日,伊莎贝和费尔南多颁布阿罕布拉法令,把西班牙的犹太人和穆斯林驱逐。大约有20万人被迫离开家园,剩下的被迫皈依基督教,并在日后再次遭到迫害。

  伊莎贝拉和斐迪南在统一西班牙之后试图利用西班牙宗教裁判所在精神层面把全国统一在天主教之下。1502年,西班牙的穆斯林被迫在接受洗礼皈依基督教和离开西班牙之间作选择。他们还试图通过联姻和欧洲其他列强联合,以达到制衡法国和统一伊比利半岛的目的。  伊莎贝拉死后把所有称号给了女儿胡安娜。胡安娜的丈夫菲利普一世在伊莎贝拉死后和斐迪南反目,但在内战爆发前病死。菲利普一世的儿子卡洛斯成为西班牙王位的继承人,其治下的西班牙帝国达到空前的强大。  伊莎贝拉被安葬在格拉纳达的王家教堂。

  伊莎贝拉和斐迪南育有五个子女:
伊莎贝拉一世(;1451年-4月22日-1504年-11月26日)是卡斯提尔的女王。她及丈夫斐迪南五世(亚拉冈的斐迪南二世)完成了收复失地运动,为日后他们的外孙卡洛斯一世统一西班牙帝国奠定了基础。其支援克里斯托弗·哥伦布开拓美洲新大陆,为开拓发展西方文明作出重大的贡献。另外他重用的德·西斯内罗斯枢机大力提升王权并压制了贵族的跋扈,让王权借由「宗教裁判所深入到基层民众,让人民成为教会的顺民,以及王室的顺民。」