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  界面与指令大致沿用前作(详见《刺客教条》),任务数量与种类、可使用武器、战斗动作及敌兵种类均有所增加。游戏增设金钱及买卖系统,并引入城镇重建及商店投资设定:在修缮刺客基地城镇中的商店后,主角能以较低价钱购买各物资,同时定期获得商店的一定利润。由于记忆追溯机器「Animus」经过改良,因此自本作开始刺客祖先能游泳和潜水。本作拥有更开放的世界观,城市版图更大,所有关键地标及人物均附有历史参考资料(当中部分重要人物外貌轮廓来自真实演员)。

  紧接前作《刺客教条》,跨国制药公司Abstergo(现代圣殿骑士团)已取得酒保戴斯蒙·迈尔斯(Desmond Miles)之刺客祖先-阿泰尔·伊本·拉阿哈德(Altaïr ibn La-Ahad)的一段记忆并计划将之灭口,但在雇员露西·斯蒂尔曼(Lucy Stillman,本为刺客但因长期与组织隔离已暗地转投圣殿骑士团)协助下二人逃到现代刺客组织之一个藏身之所,与历史学家肖恩·海斯汀(Shuan Hastings)及电脑专家丽贝卡·克琳(Rebecca Crane)会合后,三人随即著戴斯蒙使用功能更强之「Animus 2.0」(基因记忆追溯机器「Animus」的强化版)以进入其另一刺客祖先的记忆,希望籍由长期进入Animus 而带来之「血缘效果」(Bleeding Effect),于短时间内学会其刺客祖先的所有技能以对抗势力强大之现代圣殿骑士团。  1476年文艺复兴时期,17岁的埃奇欧·奥铁托雷(Ezio Auditore da Firenze)是意大利佛罗伦斯之贵族,其家族因一场政治阴谋而受牵连,父亲(银行家,真实身份实为刺客)、兄长以及弟弟被判以叛国罪名而被处以绞刑。埃奇欧带着母亲及妹妹逃离佛罗伦斯至蒙特里久尼投靠伯父马力欧·奥铁托雷(Mario Auditore),为报家族之仇及保护家人而决定跟随伯父学习战斗技能并继承父亲遗志-为佛罗伦斯统治者洛伦佐·德·美第奇(Lorenzo de Medici)效命及刺杀策划是次阴谋之帕齐家族成员。  在年轻发明家列奥那多·达·芬奇(Leonardo da Vinci)及其他市民协助下,埃奇欧在往后20年间把相关成员逐一刺杀,并了解众人之首为圣殿骑士团团长罗德里哥·波吉亚(Rodrigo Borgia),目的为推翻美第奇家族以占领佛罗伦斯,从而遂渐统领意大利。埃奇欧前往威尼斯进行调查后发现波吉亚已获得另外一颗古代遗物「伊甸碎片」,并欲成为教宗以获得教宗十字(伊甸碎片「圣杖」(The Staff))以开启位于罗马西斯廷小堂圣座下之「地窖」(The Vault)。埃奇欧在伯父及刺客组织成员协助下夺得碎片,并于1499年前往罗马刺杀已成为教宗亚历山大六世之波吉亚。  二人各以其「伊甸碎片」战斗,波吉亚夺回埃奇欧手上之碎片并逃至「地窖」但无法将之开启,埃奇欧追至后二人以徒手搏斗方式再次进行战斗,波吉亚于被击败倒地后发现自己从来没有资格进入「地窖」而求一死,但埃奇欧认为即使将之刺杀也无法使家人复生而拒绝。以「圣杖」及「伊甸碎片」之力量埃奇欧成功开启「地窖」,此时自称为弥涅耳瓦(Minerva)之立体影像启动并道出真相及预言:弥涅耳瓦与其他神明皆属于一个人类以前的先进文明(Those Who Came Before,又称「第一文明」First Civilization),地球当年因一场灾难导致大部分生命被摧毁,弥涅耳瓦与同伴为使地球复苏而以自己的形象创造了人类并籍由「伊甸碎片」控制思想。双方其后发生了战争,因人类数目远多于其创造者而胜出,弥涅耳瓦与其幸存同类为避免相同之灾难再次发生而把自己封存于世界各地之神殿内。弥涅耳瓦表示往后一切将取决于戴斯蒙的行动,影像至此消失。  此时Abstergo 已追至刺客组织的藏身之所。利用「血缘效果」之功效戴斯蒙成功与露西合力击败Abstergo 的卫兵。四人驱车移至另一藏身之所的同时尝试推敲弥涅耳瓦预言的内容。  戴斯蒙、埃奇欧及波吉亚之事迹于后继作品《刺客教条:兄弟会》续有<unk>述。

  《刺客信条II》使用havok, Autodesk HumanIK等中间件。
是育碧公司的蒙特利尔工作室开开发的一款第三人称历史奇幻类游戏。它支援Microsoft Windows、PlayStation 3、Xbox 360和Mac OS X四个平台。它是育碧公司2007年游戏《刺客教条》的续集。2009年11月PlayStation 3和Xbox 360版本的游戏发布。Windows平台的游戏发布于2010年。另于2016年11月17日在PlayStation 4和Xbox One发售与《刺客教条:兄弟会》和《刺客教条:启示录》三部曲合并的《刺客教条:埃齐欧合辑》。2017年2月14日提供简体中文支持。