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  2004年(《生化危机2》6年后),安布雷拉公司制作的T病毒因泄漏导致生化灾害,连串的负面新闻导致公司股票价格暴跌。美国联邦政府在各国政府的压力下暂停安布雷拉公司的业务,其后公司便宣告破产,所有地下研究中断,T病毒的传播得以停止。  当年被卷进浣熊市生物灾害的前警员里昂·史考特·甘乃迪(Leon S. Kennedy)已成为美国总统直辖的最高机密组织成员。某日奉命到西班牙某村庄营救总统被拐去的女儿爱旭莉·葛拉汉(Ashley Graham)。到达该处后里昂发现所有村民均与他敌对,且在对抗时发现他们效忠于一个名为「光明教团」(Los Illuminados)的邪教团体。因此里昂最严苛的冒险就此展开。

  游戏废除系列以往一直采用的第三人称固定镜头或3D转换视角,改为当时电子游戏界中首次出现的第三人称肩后视点,同时使用动作捕捉技术(Mo-Cap)使角色动作更真实。本作也于系列中首次引进金钱买卖系统,可利用在环境内或击败敌人而拾获的金钱向武器商人购买武装和补给品,或是出售物品以换取金钱。主角生命值与可携带物品量可透过使用特殊药草和增加贮藏箱容量而逐渐提高。有别于以往游戏设有存盘次数限制,本作容许无限次进度储存。  本作的主要敌人从以往受病毒感染而生的僵尸改为「卡那多」(Ganados,西班牙语「家畜」之意),牠们由受寄生体Las Plagas感染的人类变成,仍保留智慧与语言能力,且能使用武器和互相合作。  游戏也保留佣兵模式(The Mercenaries):在游戏地图中于时限内不断杀敌以获得分数。

  在2000年东京电玩展上,卡普空表示生化危机系列本篇新作《生化危机4》将会定于PlayStation 2上展开开发的工作。在2000年8月,任天堂发布了后继机种GameCube的规格,三上真司在往后的2001年春季宣布生化危机系列前传定为《生化危机0》,并且改为在GameCube上开发,作为试验主机的显存能力。在2001年东京电玩展上,三上真司表示PlayStation 2的显存能力不足,无法达到他预期的效果,于是随即中止《生化危机4》PlayStation 2版本的开发,同时宣布往后生化危机系列的游戏只会以GameCube作为开发平台。  不久三上真司跟任天堂的首席游戏设计师宫本茂达成共识,发表一连串有关生化危机系列在GameCube平台上的独占游戏开发计划,其中包括本篇新作《生化危机4》登场至GameCube。《生化危机4》的开发工作交由同样是卡普空第四开发部的柴田洋负责担任游戏监督,三上真司负责监视整个GameCube独占游戏开发计划。当时三上真司相信,玩家会因为生化危机系列的新举动而购买GameCube。  「生化危机0」在2002年11月20日公开发售,但销量未如理想。卡普空的董事会开始担心系列本篇延续作《生化危机4》在GameCube上的销量,并且积极考虑生化危机系列再次多平台的可能性。三上真司并未因为「生化危机0」的成绩而放弃支持GameCube,相反他带领的卡普空第四开发部继续为GameCube开发《生化危机4》、《P.N.03》、《红侠乔依》、《杀手7》及《Dead Phoenix》,第四开发部亦被称为卡普空 5,但最后由于「P.N.03」销售严重失败,在2004年三上真司决定接回《生化危机4》的游戏监督职位,重新专注于游戏的创作,并且大幅改动《生化危机4》的游戏系统。  其后由于卡普空业积持续下滑,加上GameCube的主机销量以及「生化危机0」游戏销量未如理想,当时卡普空要求三上真司放弃生化危机系列只支持GameCube平台但受三上真司反对。2004年11月1日(《生化危机4》GameCube版本发售前约两个半月),卡普空在未得到三上真司的同意下,宣布将会移植《生化危机4》至PlayStation 2平台上,破坏了跟任天堂的共识,同时决定三上真司不会担任移植版本的游戏监督职位,改由松下邦臣负责,并且由稻船敬二担任执行制作人,自此三上真司不再负责《恶灵古堡》系列的开发。  2007年,卡普空决定将推出《生化危机4》Wii版,配合体感操作和完整的内容,大受好评。2011年,卡普空在Xbox 360和PlayStation 3上推出与《生化危机 圣女密码》的合辑,并将画质提升到高清(720p)。2014年,卡普空在Microsoft Windows上推出高清复刻版,并将画质提升到全高清(1080p),帧率恒定为60帧每秒。2016年,卡普空在Xbox One和PlayStation 4上推出全高画质的高清复刻版。

  《生化危机3.5》或称「生化危机4原型」,是《生化危机4》最早开发的版本,这是游戏爱好者的叫法。因为三上真司认为这个版本的《生化危机4》风格太过超现实,并与《沉默之丘》相似,而在中途被叫停,并重新开发。《生化危机3.5》只开发了不到一半,目前只有几个游戏展所公开的宣传短片。其剧情大致是游戏主角里昂·史考特·甘乃迪前往安布雷拉公司欧洲总部调查途中,在一座古堡中感染了一种能使人出现幻象的病毒,即出现目前所流传的实际游戏短片中的景象。
是2005年由卡普空第四开发部(卡普空 Production Studio 4)开发,并由卡普空发行的电子游戏,最早为任天堂GameCube平台作品,其后被移植至PlayStation 2、Wii及Windows上。《生化危机4》也是第一款支援Dolby Digital Pro-Logic 2 Surrround环绕音效的系列作。《恶灵古堡4》是三上真司在整个「恶灵古堡系列」的最后一个作品。