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  样品被照射特定波长(或波段)的光,其被荧光团吸收,导致它们发出更长波长的光(例如,和被吸收的光不同的颜色)。通过使用光谱发射滤片,该照明光被从弱得多的发射荧光中分离出来。  近年来在生物学研究中,荧光标签被广泛地使用来标定生物分子,使荧光显微镜变得更加重要。它以水银灯或氙气灯为光源,搭配具激发滤片,发散滤片滤片组的光学仪器。  目前被普遍使用的荧光显微镜,是属于落射荧光显微镜(Epi-Fluorescence Microscopes,见右图),是指激发光的来源和观察的位置(接目镜),皆位于样品的同方,通过相同的光路。这些显微镜被广泛应用于生物学,并且是更先进的显微镜设计的基础,例如共聚焦显微镜或全内反射萤光显微镜(TIRF)。

  荧光显微镜要求强烈的,近乎单色光的照明,这是一些普遍的光源,比如卤素灯泡不能提供的。四种主要类型的光源的使用,包括氙气灯或带有激发滤片(Excitation Filter)的水银灯,激光,超连续光谱光源,和高功率发光二极管(LED)。激光被最广泛地用于更复杂的荧光显微技术,像共聚焦显微镜或全内反射萤光显微镜(TIRF)。而氙气灯,水银灯,和发光二极管(LED)与分色激发滤片通常被用于广角落射荧光显微镜(Epi-Fluorescence Microscopes)。
荧光显微镜是一种使用荧光或磷光物质的光学显微镜,或除此之外使用反射和吸收用于研究的有机或无机物质的特性。“荧光显微镜”是指使用荧光来产生一个图像的任何显微镜,无论是更简单的设置像落射荧光显微镜,或更复杂的设计如共聚焦显微镜,其使用光学切片,以获得更好的分辨率的荧光图像。