Po oddzieleniu stanu Missisipi tuż przed rozpoczęciem wojny secesyjnej, Barksdale zrezygnował z Kongresu, aby zostać adiutantem generalnym, a następnie kwatermistrzem generalnym Milicji Missisipi, w stopniu generała brygady, z datą 1 marca 1861 roku. 1 maja został mianowany pułkownikiem w Armii Konfederacyjnej 13 Pułku Piechoty Missisipi, pułku, który dowodził w pierwszej bitwie pod Bull Run tego lata oraz w bitwie pod Ball's Bluff w październiku. Następnej wiosny zabrał swój pułk na Półwysep Wirginii i walczył w kampanii półwyspowej i bitwie siedmiodniowej. Kiedy jego dowódca brygady, generał brygady Richard Griffith, został śmiertelnie ranny w bitwie pod Savage's Station
29 czerwca 1862 roku Barksdale przejął dowództwo nad brygadą i poprowadził ją w heroicznym, ale krwawym i daremnym ataku w bitwie pod Malvern Hill. Brygada stała się znana jako "Brygada Missisipi Barksdale'a". 12 sierpnia 1862 został awansowany na generała brygady.