Eftir að Mississippi-ríki skildi sig frá rétt fyrir upphaf borgarastyrjaldarinnar, sagði Barksdale af sér í þinginu til að verða herforingi og síðan herforingi í Mississippi-herfylkingunni, í röð brigadíegeneral, með dagsetningu 1. mars 1861. Þann 1. maí var hann skipaður fulltrúi í 13th Mississippi Infantry, regiment sem hann leiddi í fyrra slaginu við Bull Run það sumar og í slaginu við Ball's Bluff í október. Vorið eftir fór hann með herlið sitt til Virginia-hálendisins og barðist í hálendisherferðinni og sjö daga bardaga. Þegar herforingi hans, Richard Griffith, var særður í bardaga við Savage's Station
Hinn 29. júní 1862 tók Barksdale fyrirliđsveitinni og leiddi hana í hetjulega, en blóðuga og tilgangslausa árás í Baráttu Malvern Hill. Sveitin varð þekkt sem "Barksdale's Mississippi Brigade". Hann var kynntur til hershöfðings 12. ágúst 1862.