Kaupungin strateginen ja taloudellinen merkitys teki Tukholmasta tärkeän tekijän Kalmarin liiton tanskalaisten kuninkaiden ja kansallisen itsenäisyysliikkeen välillä 1500-luvulla. Tanskan kuningas Christian II pääsi kaupunkiin vuonna 1520. 8. marraskuuta 1520 tapahtui Tukholman verenvuodeksi kutsuttu vastarintahenkilöiden verilöyly, joka sai aikaan lisäkapinoita, jotka lopulta johtivat Kalmarin liiton hajoamiseen. Kun Gustav Vasa nousi valtaan vuonna 1523 ja kuninkaallinen valta perustettiin, Tukholman väestö alkoi kasvaa ja saavutti 10 000:een vuoteen 1600.
8. marraskuuta 1520