En 1985, Mukai foi seleccionada como unha das tres candidatas a Especialista de Carga útil xaponesa para a Primeira proba de procesamento de materiais (Spacelab-J) que voou a bordo da misión STS-47. Tamén serviu como especialista de carga útil de respaldo para a misión Neurolab (STS-90). Mukai logrou máis de 566 horas no espazo. Voou a bordo da misión STS-65 en 1994 e STS-95 en 1998. É a primeira muller xaponesa en voar no espazo e o primeiro cidadán xaponés en voar dúas veces. Como astronauta da NASDA, foi científica visitante na División de Fisioloxía Cardiovascular, Instituto de Investigación Biomédica Espacial da NASA, Johnson Space Center, Texas, de 1987 a 1988. Mukai permaneceu como instrutora de investigación do Departamento de Cirurxía, Baylor College of Medicine, Houston, desde outubro de 1992.
Xaponés