Sam Holbrook va començar la seva carrera com a àrbitre a l'Appalachian League l'any 1990, seguida de temporades a les lligues del mig-oest, Carolina, Texas, l'est i internacional abans de debutar a les lligues majors el juny de 1996. Holbrook va treballar la temporada de 1996 a la Lliga Americana, seguida de tres temporades a la Lliga Nacional. El 1999, va ser un dels 22 àrbitres les dimissions dels quals van ser acceptades (en una tàctica de negociació sindical fallida), i va ser reassumit el 2002, arbitrant jocs en les dues Grandes Lligues des de llavors. Holbrook ha arbitrat en cinc sèries de divisió (2005, 2007, 2010, 2013, 2019), quatre sèries de campionats de lliga (2008, 2009, 2011, 2012) i tres sèries mundials (2010, 2016
, 2019). També va arbitrar el MLB All-Star Game de 2004. Holbrook va ser nomenat cap d'equip el febrer de 2017 per MLB. A la seva tripulació de 2017 s'hi han afegit Greg Gibson, Jim Wolf i D.J. Reyburn.