Sam Holbrook şi-a început cariera de arbitru în Appalachian League în 1990, după care a jucat în Midwest, Carolina, Texas, Eastern şi International Leagues înainte de a-şi face debutul în Major League în iunie 1996. Holbrook a lucrat sezonul 1996 în Liga Americană, urmat de trei sezoane în Liga Națională. În 1999, a fost unul dintre cei 22 de arbitri ale căror demisii au fost acceptate (într-o tactică de negociere a sindicatului eșuată), și a fost reangajat în 2002, arbitrând jocuri în ambele Ligii Majore de atunci. Holbrook a jucat în cinci Division Series (2005, 2007, 2010, 2013, 2019), patru League Championship Series (2008, 2009, 2011, 2012) și trei World Series (2010, 2016).
, 2019). El a jucat și în 2004 la MLB All-Star Game. Holbrook a fost numit șef de echipaj în februarie 2017 de MLB. În echipajul său din 2017 i s-au alăturat Greg Gibson, Jim Wolf și D.J. Reyburn.