En enero de 1941, la brigada participó en la Campaña del Desierto Occidental, entrando en acción por primera vez alrededor de
Bardia, que fue capturado de los italianos durante varios días. Esto fue seguido más tarde en el mes por la captura de Tobruk, donde la 16a Brigada permaneció mientras las otras dos brigadas de la 6a División, la 17a y la 19a, participaron en otras acciones alrededor de Derna y Bengasi. En marzo, la división se concentró alrededor de Amiriya mientras se preparaban para desplegarse en Grecia, en respuesta a una invasión alemana esperada. Durante la Batalla de Grecia, la 16a Brigada ocupó Seria antes de establecerse en el paso de Veria. Cuando comenzó el ataque alemán, el 2/1 Batallón proporcionó cobertura de retaguardia mientras la brigada se retiró junto a la 4a Brigada de Nueva Zelanda. Un avance alemán en el desfiladero de Tempe dio lugar a una nueva retirada durante la cual los batallones 2/2 y 2/3 proporcionaron seguridad de retaguardia mientras el Cuerpo Anzac se retiraba a través de Larissa. Después de esto, la brigada recibió la orden de evacuar, y los elementos se retiraron por mar en Kalamata. La mayoría de la brigada fue evacuada de regreso a Egipto y posteriormente reformada en Palestina; sin embargo, elementos de la brigada desembarcaron en Creta. El 2/1 fue desembarcado en su totalidad y desplegado para defender el aeródromo de Retimo, mientras que elementos del 2/2 y 2/3 se formaron en un Batallón Compuesto de la 16a Brigada. Durante los combates, el 2/1 fue en gran parte destruido durante la breve Batalla de Creta, y la mayoría fue tomada prisionera.