Cuando estalló la Guerra Civil Española en julio de 1936, Juan Guilloto participó en el asalto de Cuartel de la Montaña, y la Batalla de Guadarrama se libró en la Cordillera de Guadarrama. Fue uno de los líderes del Quinto Regimiento, convirtiéndose en su comandante a partir de octubre de 1936. Luchó en Talavera de la Reina, Santa Olalla e Illescas (septiembre de 1936), la defensa de Madrid
y la Segunda batalla de la carretera de Corunna, así como en la batalla de Jarama (febrero de 1937).