Miután a Mississippi állam elválasztotta magát a polgárháború kezdete előtt, Barksdale lemondott a kongresszusról, hogy Mississippi milíciájának főhadnagyává, majd főhadnagyává váljon, brigádőr-generál rangban, 1861 március 1-jén. Május 1-jén ezredest nevezték ki a Konföderált Államok hadseregének a 13. Mississippi gyalogsági ezredébe, egy ezredhez, amelyet a Bull Run első csatájában vezetett azon a nyáron, és az októberben lezajlott Ball's Bluff csatájában. A következő tavasszal Virginia-félszigetre vitte a seregét, és részt vett a félszigeti hadjáratban és a Hétnapos csatákban. Amikor brigádparancsnoka, Richard Griffith tábornok halálosan megsebesült a Savage's Station csatában,
1862. június 29-én Barksdale átvette a parancsnokságot, és hősies, de véres és hiábavaló támadást indított a Malvern Hill csatában. A brigádot "Barksdale Mississippi Brigádjának" nevezték el. 1862. augusztus 12-én előléptették brigádvezérnek.