1493-ban, amikor a spanyolok letelepedtek a szigeten, és hivatalosan 1498. augusztus 5-én, Santo Domingo lett a legrégebbi európai város Amerikában. Kolumbusz Bartolomeusz alapította a települést, és La Nueva Isabela néven nevezte el, egy korábbi északi település után, amelyet I. Izabella spanyol királynő után neveztek el. 1495-ben Szent Dominik tiszteletére "Santo Domingo"-ra nevezték át. Santo Domingót "a Karib-tenger kapujának" nevezték, és azóta ő volt Hispaniola fővárosa. Expedíciók, amelyek Ponce de León Puerto Rico gyarmatosításához vezettek, Diego Velázquez de Cuéllar Kuba gyarmatosításához, Hernando Cortes Mexikó meghódításához
, és Vasco Núñez de Balboa észlelése a Csendes-óceánon mind Santo Domingo-ból indultak.