بعد ما أظهروا أن الإنزيمات يمكن أن تعمل خارج الخلية الحية، كانت الخطوة التالية هي تحديد طبيعتها الكيميائية الحيوية. لاحظ العديد من العاملين الأوائل أن النشاط الإنزيمي مرتبط بالبروتينات، لكن العديد من العلماء (مثل الحائز على جائزة نوبل ريتشارد ويلشتتر) جادلوا بأن البروتينات كانت مجرد ناقلات للإنزيمات الحقيقية وأن البروتينات في حد ذاتها غير قادرة على التحفيز. ومع ذلك، في عام 1926، أظهر جيمس بي سومنر أن إنزيم اليوريز كان بروتينًا نقيًا وتبلورها؛ فعل سومنر نفس الشيء للإنزيم كاتاليز في عام 1937. تم إثبات الاستنتاج بأن البروتينات النقية يمكن أن تكون إنزيمات بشكل نهائي من قبل نورثروبيتس وستانلي، الذين عملوا على الإنزيمات الهضمية البيبسين (1930) ، التريبسين و تشيموتريسين. حصل هؤلاء العلماء الثلاثة على جائزة نوبل في الكيمياء في عام 1965.
جائزة نوبل في الكيمياء