Johnston was enthousiast over het uitbreken van de Mexicaans-Amerikaanse Oorlog. Hij diende in de staf van luitenant-generaal Winfield Scott in de
Hij werd door Scott gekozen als de officier die de eis om te capituleren voorafgaand aan de gouverneur van de provincie zou overbrengen. Hij was in de voorhoede van de beweging in het binnenland onder brigadegeneraal David E. Twiggs en werd zwaar gewond door grapeshot bij het uitvoeren van verkenning voorafgaand aan de Slag bij Cerro Gordo. Hij werd benoemd tot luitenant-kolonel voor zijn acties bij Cerro Gordo. Nadat hij in een veldhospitaal hersteld was, ging hij terug naar het leger in Puebla. Tijdens de opmars naar Mexico-Stad was hij tweede in bevel van het "U.S. Regiment of Voltigeurs", een eenheid bestaande uit lichte infanterie of schermutselers. Hij onderscheidde zich bij Contreras en Churubusco, werd opnieuw gewond bij Chapultepec en kreeg twee brevetpromoties voor de laatste twee gevechten, waarmee hij de oorlog beëindigde als een brevet kolonel van vrijwilligers. (Na het einde van de vijandelijkheden keerde hij terug naar zijn vredestijd rang van kapitein in de topografische ingenieurs.) Winfield Scott merkte grappig op dat "Johnston een geweldige soldaat is, maar hij had de ongelukkige gave om zichzelf in bijna elk gevecht neer te schieten". Johnston's grootste angst tijdens de oorlog was de dood van zijn neef, Preston Johnston. Toen Robert E. Lee Johnston vertelde dat Preston was omgekomen door een Mexicaanse artilleriegranat bij Contreras, huilden beide officieren en Johnston rouwde de rest van zijn leven.