Nadat de staat Mississippi zich net voor het begin van de Burgeroorlog had afgescheiden, nam Barksdale ontslag uit het Congres om adjudant-generaal te worden, en vervolgens kwartiermeester-generaal van de Mississippi Militie, in de rang van brigadier-generaal, met de datum van rang 1 maart 1861. Op 1 mei werd hij benoemd tot kolonel in het Confederate States Army van de 13th Mississippi Infantry, een regiment dat hij leidde in de Eerste Slag bij Bull Run die zomer, en de Slag bij Ball's Bluff in oktober. De volgende lente nam hij zijn regiment mee naar het schiereiland Virginia en vocht in de schiereilandscampagne en de Zeven Dagen Slag. Toen zijn brigadekommandant, brigadegeneraal Richard Griffith, dodelijk gewond raakte in de Slag bij Savage's Station
Op 29 juni 1862 nam Barksdale het commando over van de brigade en leidde het in een heldhaftige, maar bloederige en nutteloze aanval in de Slag bij Malvern Hill. De brigade werd bekend als "Barksdale's Mississippi Brigade". Hij werd gepromoveerd tot brigadegeneraal op 12 augustus 1862.