Po odtržení státu Mississippi těsně před začátkem občanské války, Barksdale rezignoval z Kongresu, aby se stal generálním adjutantem a poté generálním velitelem milice Mississippi, v hodnosti brigádního generála, s datem 1. března 1861. Dne 1. května byl jmenován plukovníkem armády Konfederačních států 13. pěchoty Mississippi, pluku, který vedl v první bitvě u Bull Runu v létě a v bitvě u Ball's Bluff v říjnu. Následujícího jara vzal svůj pluk na Virgínský poloostrov a bojoval v polostrovní kampani a Sedmidenních bitvách. Když jeho velitel brigády, brigádní generál Richard Griffith, byl smrtelně zraněn v bitvě u Savage Station
Dne 29. června 1862 převzal Barksdale velení brigády a vedl ji v hrdinské, ale krvavé a marné bitvě u Malvern Hill. Brigáda se stala známá jako "Barksdaleova Mississippi brigáda". Dne 12. srpna 1862 byl povýšen na brigádního generála.