El protocolo utilizado fue publicado por Kuwa-yama en el 20056. Según este protocolo los ovocitos fueron expuestos gradualmente a una solución de equilibrio con 7,5% de EG y 7,5% de DMSO, seguido por una rápido exposición a la solución de vitrificación, con 15% de EG, 15% de DMSO y 0,5 M sacarosa. Tras 1 minuto de exposición a esta solución, hasta 2 ovocitos fueron cargados en un contenedor con 0,1 µl de volumen de carga y sumergidos rápidamente en nitrógeno líquido. Una vez dentro del nitrógeno, se cubrió con una tapa protectora. Finalmente, los contenedores fueron almacenados en un tanque de almacenamiento con nitrógeno líquido.