Posteriormente, el gen CYP21A2fue secuenciado en la Universidad de Sao Paulo según las técnicas clásicas (Wedell, 1993). Usando esta metodología, se encontró en uno de los alelos de la familia paterna (sujetos II.2, II.4, II.6) la mutación Q318X junto a la mutación R483W, la que consiste en la sustitución de una arginina por triptofano (CGG>TGG). En la familia materna (sujetos II. 1, II.3, II.5) se encontró un alelo con la mutación R483->frameshift, también conocida como R483delGGinsC, la cuál consiste en el cambio de los nucleótidos GG por C, alterando la lectura del codón. De este modo se certificó que los seis cónyuges poseen mutaciones para HSC perdedora de sal, y por lo tanto, se encuentran en riesgo de tener hijas con ambigüedad genital.