
Portuguese: 
Já falamos aqui sobre o CRISPR, um mecanismo
descoberto nas bactérias que é capaz de
cortar o DNA com precisão.
Por esse motivo ele se tornou uma ferramenta
interessante que pode ser usada em terapias
para doenças genéticas.
Mas o seu uso não se limita somente a edição
do genoma.
Vamos ver aqui mais alguns exemplos do uso
do CRISPR.
Pesquisadores estão usando o sistema CRISPR/Cas9
para descobrir quais proteínas humanas são
necessárias para a replicação do Zika vírus.
Sabemos que os vírus necessitam de células
hospedeiras para se multiplicarem, e para
isso cada vírus utiliza uma combinação
diferente de proteínas presentes nessas células.
Para tentarmos combater o vírus precisamos
ter essas informações mais específicas
sobre a sua replicação.
Assim, esses pesquisadores usaram o CRISPR
como uma ferramenta para cortar o gene que

English: 
We've talked here about CRISPR, a mechanism
found in bacteria that is able to
cut DNA with precision.
For this reason it has become an
interesting tool that can be used in therapy
for genetic diseases.
But its use is not only limited to genome edition.
Let's see here a few more examples of the use of CRISPR.
Researchers are using the CRISPR/Cas9 system
to find out which human proteins are
necessary for the Zika virus replication.
We know that viruses require cells
host to multiply, and
each virus utilizes a different combination
of proteins present in these cells.
To try to combat the virus, we must have this specific piece of information
about their replication.
Thus, these researchers used CRISPR
as a tool to cut the gene

English: 
encoding one of these proteins, and inserted
a mutation in that gene, so that the protein
that would be produced by the cell would have a mutation and it would no longer be functional.
This was repeated with different proteins.
With this experiment they could observe
how the Zika virus would behave while infecting
a cell that was not producing one of
those proteins properly.
Realizing that the virus does not replicate
in a particular cell, they managed to find
which proteins are important for
the virus.
We already know that Cas9 is the enzyme responsible
for cutting the double-stranded DNA.
However, not always a blunt end, that
is, a cut at the same position in the two
strands of DNA, is the most desired.
When we change the DNA of an organism
we also have a great concern with
cuts made in the wrong regions of the genome.

Portuguese: 
codifica uma dessas proteína, e inseriram
neste gene uma mutação, de modo que a proteína
que seria produzida pela célula teria a mutação
e não seria mais funcional.
Isso foi repetido com diversas proteínas.
Com esse experimento eles poderiam observar
como o Zika vírus se comportaria ao infectar
uma célula que não estava produzindo uma
daquelas proteínas corretamente.
Ao perceber que o vírus não se replicava
em determinada célula eles conseguiram descobrir
quais são as proteínas importantes para
o vírus.
Já sabemos que a Cas9 é a enzima responsável
pelo corte da dupla fita de DNA.
Porém, nem sempre um corte “reto”, ou
seja um corte na mesma posição nas duas
fitas do DNA, é o mais desejado.
Quando vamos alterar o DNA de um organismo
também temos uma grande preocupação com
cortes feitos em regiões erradas do genoma.

Portuguese: 
Para solucionar esses problemas foi criada
uma enzima Cas9 modificada, com o objetivo
de aumentar a especificidade de localização
da Cas9.
Essa Cas9 modificada possui uma mutação
no seu domínio catalítico, fazendo com que
corte apenas uma fita do DNA e não as duas.
Esse sistema modificado, chamado CRISPR/nCas9
pode ser usado com 2 RNA guias.
Cada RNA irá se ligar a uma fita do DNA e
em uma posição diferente, criando um corte
não reto.
Esse mecanismo evita que cortes sejam feitos
em regiões indesejadas, já que são necessários
dois cortes feitos separadamente para ter
a completa separação do DNA.
Esse tipo de corte também irá facilitar
a inserção de um fragmento de interesse
no genoma pois ele deixará algumas bases
livres que se ligarão mais facilmente ao
novo fragmento.
Além da nCas9, também foi criada a dCas9,
ela possui mutações nos dois sítios catalíticos

English: 
To solve these problems a modified Cas9 enzyme was created aiming
to increase the specificity of Cas9 targeting.
This modified Cas9 has a mutation
in its catalytic domain, resulting
in cutting of only one strand of DNA, not both.
This modified system, called CRISPR/nCas9 can be used with 2 guide RNAs.
Each RNA will bind to one DNA strand and
in a different position, creating a
sticky end.
This mechanism prevents cuts from being made
in undesired areas, as it requires
two cuts made separately to separate the DNA completely.
This type of cut will also facilitate the
insertion of a fragment of interest
into the genome because it will leave some bases
free to be linked more easily to the
new fragment.
Besides nCas9, it was also created a dCas9,
it has mutations in both catalytic sites

English: 
which prevents cutting the DNA in any
one of the strands.
This dCas9 can primarily be used
to locate a genome segment, with
help of a guide RNA attached to it, but without cutting it.
As the dCas9 will migrate to the destination determined
by the guide RNA, we can fuse it to
another protein, which will also be taken
to that specific location in the genome.
Researchers are using this CRISPR/dCas9
associated with an enzyme capable of converting
cytosine (C) into uridine (U).
As cells read uridine like
thymidine (T), this technique can be used
to correct diseases caused by mutations
where a thymidine was replaced by a
cytosine.
In place of the wrong C, we have a U correcting
this mutation.
The dCas9 can also be fused to a repressor domain.

Portuguese: 
o que a impede de cortar o DNA em qualquer
uma das fitas.
Essa dCas9 pode ser utilizada principalmente
para localizar um segmento do genoma, com
ajuda do RNA guia ligado a ela, mas sem cortá-lo.
Como a dCas9 irá migrar para o destino determinado
pelo RNA guia, nós podemos ligar a ela uma
outra proteína, que também será levada
até esse local específico no genoma.
Pesquisadores estão utilizando esse CRISPR/dCas9
associado a uma enzima capaz de converter
citosina (C) em uridina (U).
Como as células lêem a uridina como se fosse
timidina (T), essa técnica poderá ser usada
para corrigir doenças causadas por mutações
onde a timidina foi substituída por uma
citosina.
No lugar do C errado, teremos um U corrigindo
essa mutação.
A dCas9 também pode ser fusionada a um domínio
repressor.

Portuguese: 
Assim, ela será guiada pelo RNA até a região
do genoma que temos interesse, e esse domínio
repressor irá se ligar nessa região, levando
a supressão de genes específicos.
Essa técnica recebe o nome de interferência
por CRISPR, e o gene não conseguirá ser
expresso.
Mas se ligarmos a dCas9 a ativadores transcricionais
teremos a ativação por CRISPR.
Com essa fusão, a dCas9 transportará esse
ativador para o gene que queremos e então
ele terá sua expressão aumentada.
Também podemos ligar a dCas9 a uma proteína
fluorescente, como a EGFP, assim podemos utilizar
o CRISPR para localizar genes de interesse
em células vivas, o que chamamos de localização
in situ.
Desse modo é possível acompanhar a movimentação
do material genético durante as fases do
ciclo celular.
O sistema CRISPR/Cas9 tem como alvo o DNA,
mas pesquisadores descobriram e aperfeiçoaram

English: 
Thus, it will be guided by the RNA to the region of
the genome that we have interest, and that repressor
domain will bind to that region, causing the
suppression of specific genes.
This technique is called CRISPR interference, and the gene will not be
expressed.
But if we connect the dCas9 to transcriptional activators,
we have CRISPR activation.
With this fusion, dCas9 will carry this
activator for the gene we want and then
it will have its expression increased.
We can also connect the dCas9 to a fluorescent protein, such as EGFP, so we can use
CRISPR to locate genes of interest
in living cells, what we call in situ
localization.
This way, it is possible to track genetic material moving during the phases of
cell cycle.
The CRISPR/Cas9 system targets DNA,
but researchers have discovered and improved

English: 
a type of Cas9 that is able to target
and bind to RNA.
This Cas9 is able to bind to a messenger RNA,
preventing it from being translated.
They have also discovered a Cas9 that besides
binding to an RNA, it is able to cut it.
This type of Cas9 is found in bacteria 
that need to defend themselves against viruses that have
RNA as the genetic material, rather than DNA.
Scientists are making great strides
understanding and manipulation of biology
through the use of CRISPR/Cas9.
In the clinic, we can expect new therapies
for genetic diseases using genome
edition with Cas9, CRISPR interference and activation, as well as new techniques of
diagnosis using fluorescent dCas9 imaging.
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Portuguese: 
um tipo de Cas9 que é capaz de localizar
e se ligar a RNA.
Essa Cas9 é capaz de se ligar a um RNA mensageiro,
evitando que ele seja traduzido.
Também já descobriram uma Cas9, que além
de se ligar a um RNA, ela é capaz de quebrá-lo.
Esse tipo de Cas9 é encontrada em bactérias
que precisam se defender de vírus que possuem
RNA como material genético, e não DNA.
Cientistas estão fazendo grandes avanços
na compreensão e manipulação da biologia
através do uso do CRISPR/Cas9.
Na clínica, podemos esperar novas terapias
para doenças genéticas, usando edição
genômica com Cas9, a interferência e a ativação
por CRISPR, e também as novas técnicas de
diagnóstico usando imagens baseada em dCas9
fluorescente.
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