この「動画」では、
新しい遺伝子改変技術として、
多くの研究者が注目する
「クリスパー」について、
わかりやすくご説明します。
「クリスパー」と呼ばれる
画期的な技術によって、
人類はその歴史上「はじめて」、
ヒトゲノムの如何なる部位をも
正確に編集することが
できるようになりました。
2013年に
「クリスパー」が報告されて以来、
ヒトをはじめとした、
あらゆる動物細胞において、
選択的に遺伝子を
「無機能化」したり、
遺伝子を変更することができる「この技術」は、
その、「分子ハサミ」により
「遺伝子工学」を改革し続けており、
癌や、遺伝性疾患の治療における、
遺伝子療法への発展を期待されています。
元来、
「クリスパー」は、
古細菌や細菌が外来遺伝物質を崩壊するための
「適応免疫防御機構」であり、
これは、
「ガイドRNA」と
「キャスナイン・エンド・ヌクレアァゼ」、という、
２つの要素で構成されています。
ガイドRNAと、
キャスナインが、
細胞内で発現すると、
これらは複合体を形成します。
ゲノム上の
「ガイドRNA配列と相補的な配列」であり、
かつ「パム配列のすぐ上流に位置する」という
２つの条件に
合致する「ターゲット配列」へ、
この複合体が接岸します。
複合体が、ターゲットDNAに
「局在化」すると、
キャスナインによって、
非常に正確に、
期待される領域が、切断されます。
「キャスナイン」によって
産生された「DNA"二本鎖"切断」は、細胞自身が持つ
修復機構によって、
修復されます。
画面左側の
「NHEJ」、
すなわち
「非相同性末端結合・DNA修復経路」は、
修復用の鋳型が存在しない場合に
利用されます。
この経路では、
切断されたDNA末端が、
ただ単に繋ぎ合わされます。
そのため、
しばしば
「探査の挿入」または
「欠損変異」といった
「エラー」を生じ、
これにより対象遺伝子の
「翻訳読み取り枠」を破壊します。
一方、修復用の鋳型が存在する場合には、
画面右側の
「HDR」、すなわち
「相同配向性修復経路」で、
修復されます。
本来、
HDRでは
「姉妹染色文体」を修復鋳型としますが、
ゲノム編集を行う場合には人工的な鋳型、
「ドナー」を使います。
この人工的な鋳型は、「DNA"二本鎖"切断」が生じた、
部位を「挟む領域」との、
"相同配列"を含んでいます。
この方法による修復は非常に正確であり、
ターゲット遺伝子に、特異的ヌクレオチド置換を
導入するために、利用することもできます。
「NHEJ」は、
主に挿入、
または欠損による、ランダム変異を導入するために
利用することができ、非常に簡単に、
ターゲット遺伝子の「ノックアウト」を
実現することも可能です。
一方の
「HDR」は、
遺伝子ノックアウト、
遺伝子のタグ付け、特異的変異、ノックイン、
またはプロモータ-研究といった、
さまざまな目的に利用することができます。
ゲノム編集における、もっとも重要なこととして、
その標的効率があげられます。
一方で、ガイドRNAの、
5末端におけるミスマッチは、
許容性を示すため、
野生型キャスナインを利用する場合には、
しばしば、
意図していない
「オフターゲット作用」を
生じてしまう場合があります。
この「オフターゲット作用」を回避する方法として、
「ダブルニッキング法」が知られています。
野生型のキャスナインは、
２つの切断ドメインを持っていますが、
キャスナイン・ニッカーゼは、
そのひとつを不活化し、
ニックを入れることができる、
という役割だけにしたものです。
一対の「キャスナイン・ニッカーゼ」と、
「りょうさ」の標的部位・隣接領域、
それぞれに対する、2種類のガイドRNAを利用します。
通常、DNAの
「1本鎖・切断」あるいは、
ニックが入った場合、
無傷の
「相補鎖・DNA」を修復鋳型として、
HDR経路によって、
直ちに修復されます。
したがって、
一対の「キャスナイン・ニッカーゼ」と
「ガイドRNA」が、
近接した位置に存在できる場合のみ、
「二本鎖切断」を産生することができるので、
「オフターゲット作用」を
最小限に抑えることが可能、
というわけです。
「キャスナイン」、
ヌル変異体、
いわゆる「dキャスナイン」は、
野生型キャスナインの、
２つの切断ドメイン両方を不活化したものです。
切断活性がありませんので、
標的ゲノムへの
「挿入・欠損変異」や、「配向性組換え」を導入する、といった、
いわゆる
「遺伝子改変」に使用することを目的としませんが、
「ゲノム標的」において、
多大な可能性を秘めています。
たとえば、
「dキャスナイン」を「VP64」のような
「転写活性化因子」との融合体を利用して、
「転写活性化」を行うことや、
「dキャスナイン」と
「転写抑制因子」との融合体、
そして、
ターゲット遺伝子の「プロモーター領域」に対する
ガイドRNAを利用して
「転写抑制」を行うといったこと、
また、「ゲノム画像処理用」に、
「dキャスナイン」と
「蛍光タグ」の融合体を作り、
DNA標識をする、
ほかにも、「dキャスナイン」と、
抗体「エピトープタグ」の融合体を利用して、
特異的ゲノムの、
「プルダウン」を行う、クロマチン免疫沈降など、
さまざまなアプリケーションに
応用することができます。
クリスパーは、
2012年にヒトの"培養細胞"で、
「ゲノム編集ツール」として機能することが、
初めて報告されました。
それ以降、パン酵母、
ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、
線虫、
植物、マウス、など、
広範な生物種で、
「遺伝子改変ツール」として、
多くの研究者に利用されています。
「クリスパー」「キャスナイン」システムは、
「ジンク・フィンガー」や、
「ターレン」といった、
従来の
「タンパク質基盤」の
「ゲノム編集技術」に対する、
初の代替法です。
クリスパーは、そのメカニズムが簡潔、
かつ効率的なので、
分子遺伝学において、
従来法を一変させるものと受け止められており、
数々の科学分野に適用されています。
「クリスパー」「キャスナイン」は、
現代の医療システムにおいて、
広範に適用できることが示唆されていますし、
また、「遺伝子治療」や「個別化医療」の基盤となる可能性をも秘めています。
ご視聴いただき、ありがとうございました。
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